异体糖尿病大鼠来源脂肪干细胞移植治疗糖尿病大鼠创面的初步评价及其机制探讨

• 作者: 刘英开 宋菲 嵇晓芸 弓家弘 田鸣 董叫云 陆树良 青春
• 来源期刊: 中华烧伤杂志
• 关键词: 糖尿病 伤口愈合 脂肪干细胞 晚期糖基化终末产物 高糖
• 年，卷（期）: 2019,（9）
• 所属期刊栏目: 论著·组织修复重建
• 页码范围: 645-654
• 页数: 10页
• 字数: 7369字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2019.09.002

摘要

目的 探讨异体糖尿病大鼠来源脂肪干细胞(ASC)是否对糖尿病大鼠创面有促愈作用及其机制. 方法 (1)取56只12～ 16周龄雄性Wistar大鼠,按随机数字表法(分组方法下同)分为糖尿病组和健康组,每组28只.健康组大鼠不进行任何处理;糖尿病组大鼠于腹腔一次性注射10 g/L链脲佐菌素60 mg/kg,建立糖尿病模型.按随机数字表法取健康组和糖尿病组大鼠各4只,取腹股沟处脂肪组织,培养纯化ASC以获得健康大鼠来源ASC(下称nASC)和糖尿病大鼠来源ASC(下称dASC).取第3代nASC和dASC(样本数均为3),流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD105、CD31、CD34及CD44的阳性表达率,确定纯度.(2)取健康组和糖尿病组剩余大鼠各24只,每只大鼠背部制作3个直径12 mm的圆形全层皮肤缺损创面.伤后即刻,分别于每只大鼠3个创面及其创缘皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS)、2×107个/mL的nASC、2 × 10 7个/mL的dASC各0.5 mL.伤后1、3、7、12 d,按随机数字表法每组各取6只大鼠计算创面面积;取创面组织行苏木精-伊红染色,观察创面组织学形态.(3)对人ASC(hASC)进行传代培养,采用第4～7代细胞进行后续实验.将hASC分为7组,每组12个样本.空白对照组细胞用间充质干细胞培养液培养,单纯晚期糖基化终末产物(AGE)组、单纯蛋白组、单纯高糖组、单纯高渗透压组、AGE高糖联合组、蛋白高渗透压联合组细胞分别用加入终质量浓度100 mg/L AGE、100 mg/L牛血清白蛋白(BSA)、28 mmol/L D-葡萄糖、28 mmol/L甘露醇、100 mg/L AGE+ 28 mmol/L D-葡萄糖、100 mg/L BSA+ 28 mmol/L甘露醇的间充质干细胞培养液培养.培养2h及2、4、6d,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖情况.(4)取hASC,分为空白对照组、单纯AGE组、单纯高糖组、AGE高糖联合组,每组12个样本,同实验(3)相应组处理.培养0、2、4、6d,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD105、CD44、CD45阳性表达率以确定其稳态.(5)取hASC,分为AGE高糖联合组和蛋白高渗透压联合组,每组9个样本,同实验(3)相应组处理.培养2、4、6d,采用花青素3-链霉亲和素双抗体夹心技术检测细胞内蛋白表达水平.对数据进行析因设计方差分析、LSD检验及Bonferroni校正. 结果 (1)nASC、dASC的CD44阳性表达率均＞96％,CD31、CD34阳性表达率低,CD105阳性表达率为40％左右,基本符合纯度要求.(2)2组大鼠组内3种方式处理创面伤后1d面积均相近(P＞0.05).与组内PBS处理创面的(0.682 1±0.078 9)、(0.3143±0.1137)、(0.064 3±0.002 1)cm2比较,健康组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7、12d显著缩小[(0.4641±0.0926)、(0.2239±0.0727)、(0.034 3±0.012 5)cm2,P＜0.05];健康组大鼠dASC处理创面面积于伤后3、12 d显著缩小[(0.514 1 ±0.124 1)、(0.043 7 ±0.032 8)cm2,P ＜0.05],伤后7d无明显改变[(0.274 2±0.062 5)cm2,P ＞0.05].与组内dASC处理创面比较,健康组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7d显著缩小(P＜0.05),伤后12 d无明显改变(P＞0.05).与组内PBS处理创面的(0.853 5±0.204 8)、(0.670 5 ±0.164 8)、(0.131 4±0.0744)cm2比较,糖尿病组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7、12 d显著缩小[(0.633 4 ±0.132 5)、(0.331 8±0.023 5)、(0.074 2±0.003 8)cm2,P ＜0.05];糖尿病组大鼠dASC处理创面面积于伤后3d显著缩小[(0.773 6 ±0.182 2)cm2,P ＜0.05],伤后7、12 d无明显改变[(0.510 6 ±0.192 2)、(0.1144±0.003 1)cm2,P ＞0.05].与组内dASC处理创面比较,糖尿病组大鼠nASC处理创面面积伤后3、7d无明显改变(P＞0.05),伤后12 d显著缩小(P＜0.05).伤后1d各组大鼠组内3种方式处理创面组织学形态无明显差异.伤后3d,2组大鼠nASC、dASC处理创面都有少量微血管形成,PBS处理创面几乎未见微血管形成.伤后7d,2组大鼠nASC、dASC处理创面内可见较多小血管及成纤维细胞(Fb),PBS处理创面小血管及Fb略少.伤后12 d,2组大鼠nASC、dASC处理创面已基本被上皮组织覆盖;健康组大鼠PBS处理创面内肉芽组织不明显,糖尿病组大鼠PBS处理创面未全部上皮化.(3)与空白对照组比较,单纯AGE组hASC细胞量于培养2、4、6d显著减少(P＜0.05),单纯高糖组hASC细胞量于培养2、4d显著增加(P＜0.05),AGE高糖联合组hASC细胞量于培养4、6d时显著减少(P＜0.05).(4)与组内培养4d比较,空白对照组、单纯AGE组、AGE高糖联合组hASC培养6d时CD105阳性表达率明显下降(P＜0.05).各组hASC各时间点CD44阳性表达率均＞95％,CD45阳性表达率均＜2％.(5)共有7种蛋白检测值位于可信区间.2组hASC中碱性成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶组织抑制剂1表达水平均随培养时间延长呈上升趋势.AGE高糖联合组hASC中人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达水平随培养时间的延长呈上升趋势,生长相关性癌基因(GRO)表达水平则在培养6d时显著高于组内培养4d时(P＜0.05);蛋白高渗透压联合组hASC中MCP-1、GRO表达水平均随培养时间延长呈下降趋势.蛋白高渗透压联合组hASC中卵泡抑素表达水平在培养4d时明显下降,AGE高糖联合组hASC中卵泡抑素表达水平则在培养6d时显著低于组内培养4d时(P＜0.05).蛋白高渗透压联合组hASC中血管内皮生长因子(VEGF)表达水平随培养时间延长逐渐下降,AGE高糖联合组hASC中VEGF表达水平在培养4d时较组内培养2d时显著下降(P＜0.05).蛋白高渗透压联合组hASC中尿激酶型纤溶酶原激活剂受体表达水平在培养6d时较组内培养4d时显著升高(P＜0.05),且显著高于AGE高糖联合组培养6d时(P＜0.05).结论 nASC和dASC对大鼠单纯缺损伤创面都有促愈作用,但dASC对合并糖尿病大鼠创面的促愈作用不显著,这可能与高糖及AGE干预可抑制ASC增殖并影响其稳态及分泌功能有关.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	陆树良	上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心	44	427	13.0	18.0
2	田鸣	上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心	5	23	3.0	4.0
3	青春	上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心	7	30	3.0	5.0
4	刘英开	上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心	10	62	4.0	7.0
5	董叫云	上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心	5	24	3.0	4.0
6	弓家弘	上海和睦家医院骨科	1	0	0.0	0.0
7	嵇晓芸	上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心	1	0	0.0	0.0