棉铃虫Ⅳ型几丁质酶的基因克隆、酶学性质及表达谱

• 作者: 刘宁 刘小宁 古新蓉 李梦鸽 王威 王新 马纪 麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 棉铃虫 几丁质 Ⅳ型几丁质酶 酶学性质 基因表达分析
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 170-180
• 页数: 11页
• 分类号: Q966
• 语种: 中文

摘要

[目的]昆虫几丁质酶(chitinase,CHT)主要参与蜕皮、围食膜的降解和机体免疫防御等重要生理生长发育过程.本研究旨在对棉铃虫Helicoverpa armigeraⅣ型(group)几丁质酶基因进行克隆和表达分析,为以该基因作为棉铃虫防控的分子靶标提供理论依据.[方法]采用RT-PCR和RACE技术从棉铃虫中肠中克隆Ⅳ型几丁质酶基因,分别运用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和构建系统发育树.在大肠杆菌Escherichia coli(DE3)中诱导表达其体外重组蛋白,利用Westem blot进一步验证;用Ni-NTA纯化柱纯化重组蛋白,之后研究该蛋白的酶学性质.qPCR分析该基因的在棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的表达谱.[结果]克隆获得棉铃虫几丁质酶基因HaCHT4(GenBank登录号:MH500771),其cDNA长1 624 bp,ORF长1 527 bp,编码509个氨基酸,预测的分子量为55.2 kD.蛋白质序列的N末端具有信号肽,中间序列部分含有一个催化结构域(catalytic domain,CAD),C末端含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain,CBD).多序列比对显示,HaCHT4具有几丁质酶的保守区域;系统发育分析表明,HaCHT4属于Ⅳ型几丁质酶.重组蛋白His-HaCHT4在大肠杆菌中成功表达.纯化的重组蛋白对胶体几丁质底物具有降解活性,最适温度和pH分别为50℃和7,动力学参数Km和Vmax值分别为1.76±0.35 mg/mL和0.0220±0.0012 μg/mL·s.qPCR分析表明,HaCHT4在1龄和2龄幼虫期的表达量显著高于其他幼虫龄期及预蛹期;主要在中肠和脂肪体中高度表达,体壁和头部中低表达.[结论]结果提示棉铃虫HaCHT4可能参与围食膜中几丁质降解过程.这些结果为深入研究HaCHT4的功能奠定了基础,并为害虫防治提供了有用的信息.