日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

• 作者: 傅洪拓 吴旭干 孙盛明 宣富君 戈贤平 朱健
• 来源期刊: 水产学报
• 学科: 农学
• 关键词: 日本沼虾 C型凝集素结构域家族3 嗜水气单胞菌 基因表达
• 年，卷（期）: 2019,（11）
• 页码范围: 2317-2326
• 页数: 10页
• 分类号: Q786|S966.12
• 字数: 5518字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11964/jfc.20180611327

摘要

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位.结果显示,MnLec3基因cDNA全长1357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸.氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD).同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支.通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达.qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程.