烟草甲clip丝氨酸蛋白酶基因的克隆及其对外源激素和免疫胁迫的表达响应

• 作者: 严毅 杨文佳 杨洪 胡大鸣 许抗抗 赵凤 陈春旭
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 烟草甲 clip丝氨酸蛋白酶 20-羟基蜕皮甾酮 免疫胁迫 表达模式
• 年，卷（期）: 2019,（5）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 535-546
• 页数: 12页
• 分类号: Q966
• 语种: 中文
• DOI: 10.16380/j.kcxb.2019.05.002

摘要

[目的]作为细胞外信号级联通路的重要组成部分,含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶(clipdomain serine proteases,CLIPs)在昆虫发育和先天免疫过程中起着重要作用.本研究旨在克隆烟草甲Lasioderma serricorne CLIP基因,解析其在烟草甲不同发育阶段和幼虫不同组织中的表达模式,分析其在外源激素20-羟基蜕皮酮(20E)和免疫胁迫后的表达特征,为进一步研究其生理功能奠定基础.[方法]采用RT-PCR技术克隆获得烟草甲两个CLIPs基因(LsCLIP1和LsCLIP2)全长cDNA序列,并利用生物信息学软件预测其编码蛋白的结构和特征,利用MEGA 6.06构建昆虫CLIPs系统发育树;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究这两个基因在不同发育阶段[低龄幼虫(卵孵化后24 h内)、高龄幼虫(4龄以上)、蛹(化蛹后48 h以上)、早期成虫(化蛹后24 h内)和晚期成虫(化蛹后7d)]、5龄幼虫不同组织(表皮、脂肪体、肠道和剩余组织)中以及注射20E(120 ng/幼虫)和来源于大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的肽聚糖(0.2 μL)后4龄幼虫中的表达模式.[结果]克隆获得烟草甲LsCLIP1和LsCLIP2基因的cDNA全序列,其开放阅读框长度均为1 194 bp,编码397个氨基酸.序列分析显示,其氨基酸序列各自具有一个clip结构域和胰蛋白酶结构域.系统发育分析表明,CLIP1和CLIP2都属于subfamily C CLIPs.qPCR结果表明,LsCLIP1和LsCLIP2基因在所检测的各发育阶段和幼虫各组织中均有表达,分别尤以蛹期和表皮中表达量最高;经20E和肽聚糖诱导后,烟草甲幼虫体内LsCLIP1和LsCLIP2基因的表达量明显提高.[结论]推测LsCLIP1和LsCLIP2可能参与了烟草甲的蜕皮发育和对免疫胁迫的应激响应.本研究将为后续研究昆虫CLIPs的分子调控提供参考.