一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用

• 作者: 侯俊 孙杰 张浩 朱文琦 李伯安 李永利 李波 王友亮 赵思捷 鲍春梅
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: G418抗性 慢病毒载体 RNA干扰 乙型肝炎病毒x基因
• 年，卷（期）: 2019,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 528-532
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 字数: 3776字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2019.04.013

摘要

目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx)mRNA表达的抑制作用.方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2,并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性,设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体,将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2(嘌呤霉素抗性)细胞,运用G418筛选出稳定混合克隆,提取细胞总RNA,运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBx RNA表达的抑制作用.结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,细胞获得G418抗性;HBx RNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBx mRNA.结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株.