体外研究己糖激酶Ⅱ在缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用

• 作者: 吕艳玲 崔琳 张东霞 张琼 易若凡 林洁志 贾杰只 黄跃生
• 来源期刊: 中华烧伤杂志
• 关键词: 缺血 缺氧 肌细胞,心脏 己糖激酶 自噬 细胞活力
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 116-124
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2019.02.007

摘要

目的 探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞白噬流变化中的作用.方法 取6只1～2d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验.(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、6、9h组及缺血缺氧3、6、9h组,每组4孔.DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)48 h后,正常对照3、6、9h组更换新鲜DMEM/F12培养基分别培养3、6、9h,缺血缺氧3、6、9h组更换无糖无血清培养基后于37℃含体积分数1％氧气、体积分数5％二氧化碳的低氧培养箱(缺氧培养条件下同)内分别培养3、6、9h.细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力.(2)细胞分组及处理同实验(1),每组1孔.蛋白质印迹法检测细胞微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达.(3)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9h组和缺血缺氧9h+2-脱氧葡萄糖(2-DG)组,每组4孔.常规培养48 h后,正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9h;单纯缺血缺氧9h组更换无糖无血清培养基,缺血缺氧9 h+ 2-DG组更换溶有物质的量浓度为10 mmol/L 2-DG(20 μmol)的无糖无血清培养基,2组均缺氧培养9h.CCK-8法检测细胞活力.(4)细胞分组及处理同实验(3),每组1孔.蛋白质印迹法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白表达.(5)细胞分组及处理同实验(3),每组2孔.透射电镜下观察心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体情况.(6)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9h组、缺血缺氧9h+己糖激酶Ⅱ小干扰RNA1(HK-Ⅱ siRNA1)组和缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA2组,每组4孔.正常对照组和单纯缺血缺氧9h组常规培养48 h,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h +HK-ⅡsiRNA2组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h.正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9h,单纯缺血缺氧9h组、缺血缺氧9h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9h.CCK-8法检测细胞活力.(7)细胞分组及处理同实验(6),每组1孔.蛋白质印迹法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达.除实验(5)外,各实验均重复3次.对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)缺血缺氧3、6、9h组心肌细胞活力分别为0.450±0.022、0.385±0.010、0.335±0.015,分别明显低于对应正常对照3、6、9h组的0.662±0.026、0.656±0.028、0.661±0.021(t=6.21、9.12、12.48,P＜0.01).(2)与对应正常对照3、6、9h组比较,缺血缺氧3、6、9h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均显著增加(t3h =16.15、10.99、5.30,t6h=6.79、10.42、9.42,t9h=15.76、16.51、7.20,P＜0.05或P＜0.01).(3)单纯缺血缺氧9h组心肌细胞活力为0.353±0.022,较正常对照组的0.673±0.027明显降低(t=9.29,P＜0.01);缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞活力为0.472±0.025,较单纯缺血缺氧9h组明显升高(t=3.60,P＜0.05).(4)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显增加(t=9.45、8.40,P＜0.01);与单纯缺血缺氧9h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显减少(t =4.39、4.74,P＜0.05).(5)正常对照组心肌细胞中仅可见个别双层膜结构的白噬体/自噬溶酶体;与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9h组心肌细胞中双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体明显增多;与单纯缺血缺氧9h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体数量明显减少.(6)单纯缺血缺氧9h组心肌细胞活力为0.358±0.023,较正常对照组的0.673±0.026明显降低(t =9.12,P＜0.01);缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞活力分别为0.487±0.027、0.493±0.022,较单纯缺血缺氧9h组明显升高(t=3.63、4.28,P＜0.05).(7)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显增加(t=6.08、6.31、4.83,P＜0.05或P＜0.01);与单纯缺血缺氧9h组比较,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显减少(t =5.10、7.76、15.33,4.17、8.42、12.11,P＜0.05或P＜0.01). 结论 缺血缺氧上调体外培养的小鼠心肌细胞己糖激酶Ⅱ蛋白表达水平,通过损害自噬流导致心肌细胞活力下降;抑制己糖激酶Ⅱ活性或其表达可减轻心肌细胞缺血缺氧损害.