皮肤γδ T淋巴细胞调节小鼠表皮细胞增殖分化对创面愈合的影响

• 作者: 张小容 朱海杰 李雅舒 王杨平 罗高兴 胡晓红 贺伟峰 邱林
• 来源期刊: 中华烧伤杂志
• 关键词: 创伤和损伤 伤口愈合 细胞增殖 细胞分化 T淋巴细胞 胰岛素样生长因子Ⅰ 白细胞介素17
• 年，卷（期）: 2019,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 298-307
• 页数: 10页
• 字数: 8862字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2019.04.010

摘要

目的 探讨树突状表皮T淋巴细胞(DETC)和Vγ4 T淋巴细胞对小鼠表皮细胞增殖分化的影响及其在创面愈合中的作用. 方法 (1)取6只8周龄C57BL/6雄性小鼠,采用随机数字表法(分组方法下同)分为对照组和创面组,每组3只.于创面组小鼠背部剪1条长4 cm深达皮肤全层的直线切口,对照组小鼠不行任何处理.伤后3d,断颈处死2组小鼠,取创面组小鼠背部距创缘5 mm内的皮肤,取对照组小鼠相应部位正常皮肤制成单细胞悬液,流式细胞仪检测表达白细胞介素17A(IL-17A)的Vγ4 T淋巴细胞的百分比及表达胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的DETC百分比.(2)取10只8周龄C57BL/6雄性小鼠,分为对照组和Vγ4T淋巴细胞清除组,每组5只.Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠腹腔注射200 g亚美尼亚仓鼠抗小鼠Vγ4 T淋巴细胞单克隆中和抗体,对照组小鼠腹腔注射等量亚美尼亚仓鼠Ig,分别于背部脊柱两侧各打1个深达皮肤全层的孔,观察伤后1～8d创面愈合情况,并计算剩余创面面积百分比.(3)取6只8周龄C57BL/6雄性小鼠,同实验(2)进行分组及处理,每组3只.伤后3d,蛋白质印迹法检测创缘表皮组织IL-17A和IGF-Ⅰ的蛋白表达.(4)取30只3d龄C57BL/6雄性小鼠,断颈处死后提取表皮细胞,流式细胞仪(下同)检测角蛋白14阳性细胞率.(5)另取小鼠表皮细胞,分为对照组、IGF-Ⅰ组与IL-17A组,每组3孔(下同).IGF-Ⅰ组与IL-17A组细胞分别加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL的重组小鼠IGF-Ⅰ和重组小鼠IL-17A,对照组细胞加入等量无菌磷酸盐缓冲液(PBS).培养5d后,检测角蛋白14阴性细胞率.另取小鼠表皮细胞,同前进行分组及处理,培养10 d后,检测角蛋白10阳性细胞率.(6)另取小鼠表皮细胞,加入4 mmol/L羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染液,分为对照0d组、对照7d组、IGF-Ⅰ组、IL-17A组.IGF-Ⅰ组、IL-17A组细胞同实验(5)对应组进行处理,对照0d组、对照7d组细胞同实验(5)对照组进行处理.对照0d组细胞培养0d,余3组细胞培养7d,检测CFSE荧光波峰位置.(7)另取小鼠表皮细胞,分为对照组、IGF-Ⅰ组.IGF-Ⅰ组细胞加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL重组小鼠IGF-Ⅰ,对照组细胞加入等量无菌PBS,培养5d后,同前进行角蛋白14和CFSE染色,检测CFSE阳性细胞角蛋白14阴性细胞率.另取小鼠表皮细胞,分为对照组与IL-17A组,IL-17A组细胞加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL重组小鼠IL-17A,对照组细胞加入等量无菌PBS,培养5d后,检测CFSE阳性细胞角蛋白14阴性细胞率.对数据行单因素方差分析和t检验. 结果 (1)伤后3d,对照组小鼠正常表皮组织中表达IGF-Ⅰ的DETC百分比为(9.9±0.8)％,明显低于创面组小鼠创缘表皮组织中的(19.0±0.6)％,t=8.70,P＜0.01;对照组小鼠正常表皮组织中表达IL-17A的Vγ4 T淋巴细胞百分比为(0.123 ±0.024)％,明显低于创面组小鼠创缘表皮组织中的(8.967±0.406)％,t=21.77,P＜0.01.(2)对照组小鼠伤后1～4d创面周围有明显的炎症反应;伤后5～8d,创面面积仍较大.Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠伤后1～4d创面周围炎症反应较轻;伤后5～8d,创面面积明显缩小.伤后3～7d,Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠剩余创面面积百分比明显低于对照组(t=5.92、5.74、7.17、5.38、5.57,P＜0.01);培养1、2、8d,2组小鼠剩余创面面积百分比相近(t =1.46、3.17、3.10,P＞0.05).(3)伤后3d,与对照组比较,Vγ4T淋巴细胞清除组小鼠创缘表皮组织的IL-17A蛋白表达明显下降,IGF-Ⅰ蛋白表达明显升高(t=8.47、19.24,P＜0.01).(4)小鼠表皮细胞角蛋白14阳性细胞率为94.7％.(5)培养5d后,对照组小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显高于IGF-Ⅰ组,明显低于IL-17A组(t=7.25、5.64,P＜0.01).培养10d后,对照组小鼠表皮细胞角蛋白10阳性细胞率明显高于IGF-Ⅰ组,明显低于IL-17A组(t=3.99、10.82,P＜0.05或P＜0.01).(6)相较于对照0d组,对照7d组、IGF-Ⅰ组和IL-17A组小鼠表皮细胞培养7d后CFSE荧光波峰左移.相较于对照7d组,IGF-Ⅰ组和IL-17A组小鼠表皮细胞培养7d后CFSE荧光波峰均左移.(7)培养5d后,对照组CFSE阳性小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显高于IGF-Ⅰ组(t=9.91,P ＜0.01),对照组CFSE阳性小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显低于IL-17A组(t=6.49,P＜0.01). 结论 在创面愈合过程中,DETC分泌的IGF-Ⅰ促进小鼠角蛋白14阳性表皮细胞增殖并抑制其终末分化,Vγ4T淋巴细胞分泌的IL-17A促进其增殖及终末分化,从而影响创面愈合.