体外构建工程化汗腺类器官的初步研究

• 作者: 付小兵 孙晓艳 陈润开
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 谱系重编程 类器官 汗腺再生 创伤修复
• 年，卷（期）: 2020,（4）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 384-390
• 页数: 7页
• 分类号: R644
• 字数: 5029字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2020.04.07

摘要

目的 应用谱系重编程技术将表皮角质细胞转分化为汗腺样细胞,并在体外构建三维培养体系,诱导工程化的汗腺样细胞自组装为汗腺类器官,以实现汗腺功能性修复.方法 采用CRISPR/dCas9系统上调内源性外胚层发育不全(EDA)基因在人永生化表皮角质(HaCaT)细胞中的表达,筛选阳性克隆后进行诱导培养.将细胞分为HaCaT组(HaCaT细胞使用汗腺培养基培养)、HaCaT+Dox组(HaCaT细胞使用含5μg/ml Dox的汗腺培养基培养)、HaCaT-E组(HaCaT-E细胞使用汗腺培养基培养)、HaCaT-E+Dox组(HaCaT-E细胞使用含5μg/ml Dox的汗腺培养基培养),采用RT-PCR及Western blotting检测EDA基因在各组细胞中的表达水平,以验证质粒转染是否成功.另将细胞分为HaCaT-E组(汗腺培养基组)及HaCaT-E+Dox组(汗腺培养基+5μg/ml Dox组),利用免疫荧光染色鉴定汗腺表面标记物的表达水平,以验证HaCaT细胞是否成功重编程为汗腺样细胞.随后以Matrigel为主体支架模拟汗腺发育微环境,在体外诱导汗腺样细胞自组装形成汗腺类器官,并采用免疫荧光染色检测汗腺表面标记物的表达情况.将汗腺类器官移植至裸鼠烫伤创面后,采用碘-淀粉发汗实验及组织形态学方法检测工程化的汗腺类器官参与汗腺再生及皮肤创面修复的情况.结果 CRISPR/dCas9慢病毒表达系统转染后,筛选获得HaCaT-E细胞.RT-PCR检测结果显示,与HaCaT组比较,HaCaT-E+Dox组细胞中EDA mRNA的表达水平上调(4.62±0.19)倍,差异有统计学意义(P<0.05),而HaCaT+Dox组及HaCaT-E组则未见明显上调,差异无统计学意义(P>0.05).Western blotting检测结果显示,HaCaT组、HaCaT+Dox组、HaCaT-E组及HaCaT-E+Dox组的EDA蛋白表达趋势与RT-PCR检测结果基本一致.经含强力霉素的汗腺培养基诱导培养2～7 d,细胞形态逐渐变为长梭形,呈网络样生长,并表达汗腺表面标记物角蛋白18(CK18)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、水通道蛋白5(AQP5).在含有Matrigel的三维培养体系中混合培养7 d后,细胞增殖、体积增大,形成具有囊腔的汗腺类器官,且表达汗腺表面标记物和功能性标记物CK18、α-SMA、AQP5.体内实验表明,移植组小鼠脚掌碘-淀粉发汗实验为阳性.组织免疫荧光染色结果进一步显示,绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞主要分布于表皮的基底层及亚基底层,且真皮深层及皮下组织内可见管腺状结构,同时表达GFP及汗腺细胞标记物CK18、α-SMA.结论 采用CRISPR/dCas9系统上调内源性EDA基因可重编程表皮角质细胞为汗腺样细胞.以Matrigel为主体支架构建的三维培养环境可在体外诱导工程化的汗腺样细胞自组装并发育形成汗腺类器官.这些工程化的类器官不但具备汗腺原基的表型及结构特征,还能在体内促进汗腺再生,从而实现创面的功能性修复.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	付小兵	解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心	215	1520	18.0	26.0
5	孙晓艳	解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心	22	112	5.0	10.0
9	陈润开	天津医科大学研究生院	1	0	0.0	0.0