通过SpyTag/SpyCatcher介导的自发环化提高酿酒酵母S288C中Ulp1的稳定性

• 作者: 张菡 杨国宇 王梦珂 王江 贾宾 郭婉莹 郭玉堃 郭豫杰 韩莹倩
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 小泛素样修饰蛋白(SUMOs) 泛素样特异蛋白酶1(Ulp1) 重组截断型Ulp1 SpyTag/SpyCatcher 环化结构 稳定性
• 年，卷（期）: 2020,（2）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 369-380
• 页数: 12页
• 分类号: S852.23
• 字数: 1471字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2020.02.019

摘要

SpyTag/SpyCatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性.研究显示,SpyTag/SpyCatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性.小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifiers,SUMOs)是一种十分有效的促溶标签,广泛应用于重组蛋白的原核表达过程中.泛素样特异蛋白酶1(ubiquitin-like-specific protease 1,Ulp1)是SUMO特异性蛋白酶中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下,不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但较差的稳定性限制了其应用.本研究使用截断型Ulp1(Gly304～Lys621)代替全长Ulp1,并对其序列进行了优化,得到了重组截断型Ulp1.重组截断型Ulp1既具有Ulp1全部的酶活性,又能更好地在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达.本研究设计并表达了重组截断型(recombinant truncated Ulp1-His6,rtUlp1)、SpyTag-rtUlp1-SpyCatcher-His6(crtUlp1)和Spy-TagΔDA-rtUlp1-SpyCatcherΔEQ-His6(lrtUlp1)三种蛋白酶.综合比较3种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,结果显示,crtUlp1的最佳反应酶切温度比lrtUlp1高10℃,比rtUlp1高5℃.crtUlp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留87.3％的相对酶活,lrtUlp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留43.69％的相对酶活,而rtUlp1几乎丧失了全部的酶活.且crtUlp1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rtUlp1与lrtUlp1只在其最佳反应pH下表现出较高的酶切活性.本研究利用SpyTag/SpyCatcher技术获得了高稳定性的rtUlp1,评价了环化结构对rtUlp1热稳定性的影响以及SpyTag/SpyCatcher技术对rtUlp1热稳定性提高的效果,为获得具有高热稳定性的SUMOs特异性蛋白酶及促溶标签SUMOs的广泛使用提供技术基础.