米曲霉裂解性多糖单加氧酶的异源表达与性质分析

• 作者: 冯玉和 周叶波 孙小宝 尹尚军 张慧恩 施鑫磊 王谦 钱国英 陈书昕
• 来源期刊: 微生物学报
• 关键词: 米曲霉 裂解性多糖单加氧酶 氧化 毕赤酵母 酶学性质 底物结合
• 年，卷（期）: 2020,（1）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 183-199
• 页数: 17页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20190134

摘要

[目的]裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一类以氧化方式断裂多聚糖糖苷键的新型木质纤维素降解酶,本文旨在挖掘新型LPMOs并研究其性质.[方法]从米曲霉中克隆LPMO基因,利用毕赤酵母表达系统进行异源表达,研究其酶学性质和还原剂对其活性的影响,进一步探讨LPMO与糖苷水解酶协同作用时的底物结合现象.[结果]AoLPMO2和AoLPMO5序列分析显示,两种蛋白都为辅助酶类9家族的LPMOs;电击转化至真核毕赤酵母GS115中,获得双拷贝转化子GS/AO5-4,经1％甲醇诱导4d后,上清液蛋白表达量为0.19±0.01 g/L.重组蛋白分子量约34 kDa,高于理论分子量,推测可能存在翻译后修饰.酶学性质分析表明,AoLPMO5对刺槐豆胶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.0,Km和Vmax分别为8.72±1.99 mg/mL和109.4± 12.8μmol/(s.mg).0.1 mmol/L Cu2+促进酶活性提高(7.1 0±1.32)％(P＜0.05),0.5、2.0和2.5 mmol/L H2O2分别促进酶活性提高(21.11±6.17)％ (P＜0.01)、(20.22±1.13)％ (P＜0.01)和(18.40士2.86)％ (P＜0.01),而没食子酸和维生素C对活性无明显作用.在反应前期,AoLPMO5与刺槐豆胶底物结合从而影响甘露聚糖酶BsMAN3的降解作用.而在反应后期,AoLPMO5与BsMAN3则表现出协同增效作用.[结论]AoLPMO5是一种全新的生物质降解酶,阐明其酶学性质和底物作用方式,将为天然木质纤维素类底物的高效转化与生物炼制,如第二代生物乙醇、功能性低聚寡糖等生产建立基础.