罗非鱼湖病毒核蛋白的克隆表达、抗体制备及其组织分布

• 作者: 吴灶和 周萌 张凯 李嘉波 林蠡 梁日深 秦真东 苏国茂 莫金凤 赵丽娟
• 来源期刊: 水产学报
• 学科: 农学
• 关键词: 吉富罗非鱼 罗非鱼湖病毒 NP蛋白 多克隆抗体 组织表达 免疫因子
• 年，卷（期）: 2020,（2）
• 页码范围: 276-288
• 页数: 13页
• 分类号: S941.41
• 字数: 7840字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11964/jfc.20190211657

摘要

近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行,对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁.中国是罗非鱼第一养殖大国,尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道,鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种,其对TiLV的感染特性研究具有重要意义.本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染,随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因.罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1044 bp,开放读码框(ORF)为954 bp,编码317个氨基酸,预测分子量为36.38 ku;5′非编码区(NCR)为19 bp,3′非编码区(NCR)为972 bp.系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP).随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白,在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1:51200,且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白.对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察,发现肝脏组织坏死并形成合胞体,脾脏部分细胞出现空泡、坏死,含铁血黄素增多,头肾细胞坏死,鳃丝上皮细胞明显解离脱落,鳃小片黏连,脑组织细胞肿大.通过蛋白印迹法(WB)和免疫组化(IHC)对人工感染TiLV的吉富罗非鱼不同组织进行检测,结果显示,NP蛋白在肝脏、脑、体肾和头肾等组织中均有表达,以肝脏组织中表达量最高.为了解吉富罗非鱼对TiLV的免疫反应,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定免疫因子TNF-α和TGF-β在主要免疫器官脾脏和头肾组织中的表达.研究表明,在感染早期(感染后12～24 h),病毒可显著抑制TNF-α和TGF-β在脾脏和头肾中的表达,可能通过抑制宿主这些免疫因子来促进病毒自身早期的复制.本研究将为进一步解读TiLV的致病机理及其高效防控提供理论基础.