基于CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株及对IFN-β的影响

• 作者: 刘文森 常影 王燕 董明鑫 许娜 金连海 陈为
• 来源期刊: 中国兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: CRISPR/Cas9技术 TRIF基因 基因敲除 RAW264.7细胞
• 年，卷（期）: 2020,（1）
• 所属期刊栏目: 预防兽医学
• 页码范围: 66-71
• 页数: 6页
• 分类号: S852.2
• 语种: 中文
• DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2020.01.12

摘要

利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株.首先,制备Cas9表达慢病毒,感染RAW264.7细胞,通过Puromycin抗性进行初步筛选,PCR法进行鉴定.其次,设计3条特异性识别TRIF基因的sgRNA(sgTi1、sgTi2、sgTi3),将其转入稳定表达Cas9蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察转入效果,PCR和Western blot法验证基因敲除情况.最后,挑选基因敲除效果最佳细胞株,经TRIF激活剂诱导后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测IFN-β表达水平.结果 显示:感染后的RAW264.7-Cas9细胞Cas9基因扩增产物升高,说明成功获得稳定表达Cas9基因的RAW264.7细胞.含目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9细胞后,荧光显微镜下可明显观察到目的基因已成功导入;PCR结果显示,与对照组比较,分别导入sgTi1、sgTi2、sgTi3的3组RAW264.7细胞TRIF表达均受到抑制,Western blot进一步验证3组RAW264.7细胞TRIF蛋白表达均下降且sgTi1组下降最显著,说明TRIF基因敲除成功.经TRIF激活剂诱导,与RAW264.7-Cas9-NC细胞比较,敲除TRIF基因后RAW264.7细胞IFN-β mRNA水平受到明显抑制.结果 表明:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	许娜		18	29	3.0	5.0
2	金连海		25	33	3.0	4.0
3	常影		19	31	3.0	5.0
4	陈为		16	61	4.0	7.0
5	王燕	军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所	2	0	0.0	0.0
6	董明鑫	军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所	1	0	0.0	0.0
7	刘文森	军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所	1	0	0.0	0.0