肝素差向异构酶在昆虫细胞中的表达和活性测定

• 作者: 张晶晶 刘纯慧 王晓 马亚卿 张桂娇 王亚利 唐凤琰
• 来源期刊: 药物生物技术
• 关键词: 人肝素差向异构酶 昆虫细胞 杆状病毒表达系统 转染效率 感染复数 感染时间 酶活测定
• 年，卷（期）: 2020,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 408-414
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 语种: 中文
• DOI: 10.19526/j.cnki.1005-8915.20200504

摘要

葡糖醛酸C5-差向异构酶(C5-epi)是肝素/硫酸乙酰肝素生物合成的关键酶之一,本文通过无缝克隆技术将人源C5-epi基因克隆至pFastBacl质粒构建重组载体,转化至含杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DHlOaBac感受态细胞并发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-C5-epi;在脂质体介导下将穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9产生重组病毒,扩增病毒感染昆虫细胞Sf9进行蛋白表达;采用Western blot-ting鉴定Sf9培养上清中C5-epi的表达情况,以合成的肝素五糖为底物测定C5-epi酶的活力;采用Reed-Muench两氏计算法和TCID50计算病毒滴度并优化表达条件;采用Ni-NTA亲和层析柱纯化上清液.结果表明,Western blotting表明重组C5-epi以分泌蛋白的形式在昆虫细胞Sf9中正确表达,且具有C5异构化酶活性;采用感染复数(MOI)为1、感染时间(TOI)为72 h,重组活性酶在昆虫细胞Sf9中的表达达到峰值;纯化后的C5-epi的酶比活达118.57 U/μg,是大肠杆菌表达的酶活27.32倍.因此,在Sf9昆虫细胞中表达得到活性高的重组人源C5-epi酶,适合用于肝素/硫酸乙酰肝素寡糖的高效合成和规模化制备.