裂殖酵母Pmt3蛋白的原核表达纯化与结晶研究

• 作者: 杨祥伟 王永石 柳东旭 房万宇 王睿 姜彦楠 连福明
• 来源期刊: 生物技术
• 关键词: 裂殖酵母 Pmt3 小泛素样修饰蛋白 表达 纯化 结晶
• 年，卷（期）: 2020,（5）
• 所属期刊栏目: 论著|Research Paper
• 页码范围: 424-430
• 页数: 7页
• 分类号: Q518.2
• 语种: 中文
• DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2020.05.0067

摘要

[目的]克隆裂殖酵母pmt3基因,利用大肠杆菌过量表达Pmt3重组蛋白,并进行Pmt3蛋白的纯化及晶体培养.[方法]利用PCR体外扩增pmt3基因的编码序列,通过NdeⅠ和BamH Ⅰ限制性酶切和Solution Ⅰ连接技术将其克隆至pET28a载体,利用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达Pmt3重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析柱HisTrap(5 mL)和分子筛层析柱Superdex 75 (16/60)依次纯化目的蛋白,利用超滤离心管进行蛋白质的浓缩,采用48孔板坐滴气相扩散法进行蛋白晶体初筛.[结果]在16℃恒温条件下经0.3 mmol/L IPTG诱导后Pmt3蛋白过量表达.经Ni-NTA亲和层析和Superdex 75分子筛层析纯化得到了高纯度的Pmt3蛋白,最终蛋白浓缩至9.5 mg/mL.经96条件蛋白结晶条件筛选,在18℃恒温稳定条件下获得了Pmt3蛋白晶体.结晶条件为:0.1 mol/L sodium acetate trihydrate,pH 4.6,8％ polyethyleneglycol 4000.[结论]裂殖酵母Pmt3蛋白在16℃条件下在大肠杆菌中被IPTG诱导表达.经亲和层析和分子筛层析两步纯化,获得了纯化的重组Pmt3蛋白.经96结晶条件18℃培养后,获得了蛋白质棒状晶体,为后续Pmt3的功能研究及三维结构的解析提供基础.