基于荧光共振能量转移技术的快速检测CA16型手足口病病原体新方法的建立及其评价

• 作者: 代天聪 刘玉申 曹晓炼 李卓林 李娟 王娟 聂玮 郭潇潇
• 来源期刊: 吉林大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 柯萨奇病毒A组16型 荧光共振能量转移 手足口病 鸡卵黄抗体 金纳米粒子
• 年，卷（期）: 2020,（1）
• 所属期刊栏目: 方法学
• 页码范围: 169-175
• 页数: 7页
• 分类号: R373.23|R446.6
• 字数: 4279字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200130

摘要

目的:基于荧光共振能量转移(FRET)技术建立一种柯萨奇病毒A组16型(CA16)手足口病病原体快速检测的新方法,并对检测效果进行评价,使其达到疾病爆发流行期间大样本量检测的要求.方法:采用SDS-PAGE凝胶电脉技术和蛋白浓度定量试剂盒测定CA16鸡卵黄抗体(CA16-IgY)纯度及蛋白水平,采用间接ELISA法检测抗体效价及特异性,采用紫外可见光谱(UV-Vis)、红外光谱(FTIR)和透射电子显微镜(TEM)等方法对所制备的金纳米粒子(AuNPs)及其生物探针(IgY-AuNPs)的尺寸、形貌和性能进行表征;基于FRET技术构建CA16检测体系,通过优化检测体系中IgY-AuNPs浓度、氯化钠(NaCl)用量和荧光恢复时间等指标,对检测方法的灵敏度、特异度和临床样本检测进行评价.结果:CA16-IgY纯度较高,抗体平均蛋白水平为12.15 mg·L-1,抗体效价高达1:128000,特异性良好;AuNPs及IgY-AuNPs的UV-Vis、FTIR和TEM观察结果,IgY已成功标记至AuNPs表面,提示已通过静电自组装成功制备了可以特异性识别CA16的IgY-AuNPs.基于FRET技术构建CA16检测体系,体系经优化后,确定IgY-AuNPs的最佳浓度为0.52×10-3 g·L-1,NaCl的最佳用量为40μL,荧光恢复最佳时间为90 min,建立的检测方法的标准曲线为I525nm=15.452 IgC-9.746,R2=0.9932,检测限为1×104 PFU·mL-1,与临床检测金标准实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法比较,一致率可达93.75％.结论:成功建立了CA16型手足口病病原体的快速检测新方法,可用于实验室和临床检测.