基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)质控品制备

• 作者: 王国强 于茵茵 曾华辉 王旭东 吴玉彬 尚立芝 李玉林 张怡青 张西西 张振强 王云龙
• 来源期刊: 中国生物工程杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 新型冠状病毒(2019) MS2噬菌体 盔甲RNA 病毒样颗粒
• 年，卷（期）: 2020,（12）
• 所属期刊栏目: 新型冠状病毒检测与治疗
• 页码范围: 31-40
• 页数: 10页
• 分类号: Q816
• 语种: 中文
• DOI: 10.13523/j.cb.2009008

摘要

目的:制备热稳定性好、耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品.方法 :分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A.合成包含ORFlab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S.通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征.全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性.结果 :成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23-28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA.加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天.结论 :在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品.Nase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品.方法:分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A.合成包含ORFlab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S.通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征.全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性.结果:成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23-28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA.加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天.结论:在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品.