小鼠炎症创面组织匀浆体外模拟创面炎症微环境的可行性研究

• 作者: 徐广超 杨沁馨 王旗 王达利 祁放 邓呈亮 郝艺 魏在荣
• 来源期刊: 中华烧伤杂志
• 关键词: 炎症 成纤维细胞 外泌体 组织匀浆 微环境 人羊膜间充质干细胞
• 年，卷（期）: 2020,（11）
• 所属期刊栏目: 论著·创面修复与微环境
• 页码范围: 1024-1034
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200720-00351

摘要

目的:探讨小鼠炎症创面组织匀浆体外模拟创面炎症微环境的可行性。方法:(1)取10只8周龄C57BL/6雄性小鼠，在背部中线两侧用打孔器各取直径1.0 cm的圆形全层皮肤组织，制作正常皮肤组织匀浆上清液。形成全层皮肤缺损创面48 h后，取距创缘2 mm内创面组织，制作炎症创面组织匀浆上清液。取2种组织匀浆上清液，调整总蛋白质量浓度为1 mg/mL，酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量，样本数为6。(2)取原代人脐带间充质干细胞(hUCMSC)并培养至第3代，培养48 h后提取正常外泌体。另外取第3代hUCMSC，分别加入总蛋白质量浓度为30、50、100 μg/mL正常皮肤组织匀浆上清液和炎症创面组织匀浆上清液，培养48 h后，提取30、50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体和30、50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体。取正常外泌体、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体和30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体，透射电子显微镜下观察外泌体形态，纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径，蛋白质印迹法检测CD9和CD63表达。(3)取1 d龄C57BL/6小鼠乳鼠20只，分离培养原代成纤维细胞(Fb)和第3代Fb，倒置相差显微镜下观察细胞形态。取第3代Fb，培养2 h，利用细胞爬片法结合免疫荧光法观察波形蛋白的表达。(4)取第3代Fb，按随机数字表法分为对照组，正常外泌体组，30、50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组及30、50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组，每组4孔。对照组不进行任何处理，其余7组依次加入实验(2)中制备的正常外泌体，30、50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体和30、50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体，并调整外泌体终质量浓度为10 μg/mL。培养48 h，采用细胞计数试剂盒8法检测8组细胞活力。(5)取2个批次第3代Fb，同实验(4)进行分组及处理，每组4孔，并分别调整外泌体终质量浓度为1、10 μg/mL，采用细胞划痕试验检测培养6、12、24 h细胞迁移率。(6)取2个批次第3代Fb，同实验(4)进行分组及处理，但不设置对照组，每组3孔，并调整外泌体终质量浓度为1、10 μg/mL，实时荧光定量反转录PCR法检测培养48 h转化生长因子β 1(TGF-β 1)、TGF-β 3、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Bonferroni法。 结果:(1)伤后48 h，小鼠炎症创面组织匀浆上清液中TNF-α含量为(116±3)pg/mL，显著高于正常皮肤组织匀浆上清液的(97±5)pg/mL， t＝3.306， P<0.05。(2)hUCMSC正常外泌体、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体、30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体均呈典型茶托样；3种hUCMSC外泌体粒径为30～150 nm，均在外泌体正常粒径范围内；3种hUCMSC外泌体CD9和CD63均呈阳性表达。(3)原代细胞轮廓清晰，呈突起的纺锤形、不规则多角形或细长条状；第3代细胞形态与原代细胞相近。培养2 h，细胞中波形蛋白呈阳性表达，细胞鉴定为Fb。(4)培养48 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞活力为(137.4±2.8)%，明显高于对照组的100%、正常外泌体组的(107.5±2.4)%、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组的(113.3±3.2)%及50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组的(104.0±2.0)%、(101.9±1.5)%， P<0.01, 30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞活力明显高于对照组、正常外泌体组及50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组[(103.4±2.2)%、(102.5±1.4)%]， P<0.01。(5)外泌体终质量浓度为1 μg/mL时，培养6、12、24 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组及50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组( P<0.05)；培养12 h，30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组以及50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。外泌体终质量浓度10 μg/mL时，培养6 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组( P<0.05)；30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。培养12、24 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组及50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组( P<0.05)；30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组及50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。(6)外泌体终质量浓度1 μg/mL时，7组细胞培养48 h TGF-β 1、TGF-β 3、α-SMA mRNA表达量组间总体比较，差异无统计学意义( F＝1.123、1.537、1.653， P>0.05)。外泌体终质量浓度为10 μg/mL时，培养48 h，7组细胞TGF-β 1、α-SMA mRNA表达量组间总体比较，差异无统计学意义( F＝1.487、1.308， P>0.05)。50 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞培养48 h TGF-β 3 mRNA表达量明显高于正常外泌体组、50 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组及30、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。 结论:小鼠炎症创面组织匀浆上清液预处理对hUCMSC外泌体的总蛋白含量无影响，低浓度炎症创面组织匀浆上清液刺激所得的hUCMSC外泌体能够上调Fb的增殖和迁移能力，但炎症创面组织匀浆上清液中的炎症介质含量过低，不足以有效启动间充质干细胞抗炎及组织修复旁分泌效应。