利用电转的方法对T细胞TET2基因敲除并探讨TET2对T细胞增殖的影响

• 作者: 傅雅娟 叶洲杰 李兆龙 杨雷 沈阳坤
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: Cas9核糖核蛋白(Cas9RNP) TET2 电转染 基因敲除 T细胞增殖
• 年，卷（期）: 2020,（1）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 229-237
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0891

摘要

近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视.然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用.与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率.TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作为细胞中的DNA去甲基化酶,在细胞基因组表观遗传学中起着重要调控作用.研究表明TET2基因的缺失能够促进CAR-T细胞的快速繁殖,产生强力的CAR-T细胞.该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对TET2基因进行敲除.首先对sgRNA进行体外转录,与大肠杆菌诱导表达的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP),并在体外酶切验证sgRNA的活性.接着利用电转染技术将Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)带入细胞内,并检测T细胞基因编辑效率.最后利用流式细胞分析技术检测T细胞的增殖情况.基因测序与T7EⅠ 酶切结果表明,T细胞中的TET2基因被成功敲除,T细胞活力和功能并未受到影响.流式细胞技术,CCK-8以及台盼蓝细胞活率检测结果显示缺失Tet2蛋白后,T细胞的增殖速率明显快于野生型T细胞.该研究为非病毒载体替代传统的慢病毒载体构建携带嵌合抗原T细胞奠定了基础,具有制备周期短,安全性高的特点.同时TET2缺失促进了CAR-T细胞的增殖,使其能够引发有效的抗肿瘤反应,为CAR-T细胞免疫治疗提供了新的思路.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李兆龙	福建省农业科学院畜牧兽医研究所	14	17	3.0	3.0
2	沈阳坤	福建师范大学南方生物医学研究中心	5	2	1.0	1.0
3	傅雅娟	福建师范大学南方生物医学研究中心	7	14	3.0	3.0
4	杨雷	福建师范大学南方生物医学研究中心	1	0	0.0	0.0
5	叶洲杰	福建省儿童医院中心实验室	1	0	0.0	0.0