山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定

• 作者: 郑巧玲 申威 姚文孔 徐伟荣
• 来源期刊: 园艺学报
• 学科: 农学
• 关键词: 山葡萄 低温胁迫 cDNA三框文库 VaCIPK18 VaPYL9 互作分析
• 年，卷（期）: 2020,（12）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 2301-2316
• 页数: 16页
• 分类号: S663.1
• 语种: 中文
• DOI: 10.16420/j.issn.0513-353x.2020-0115

摘要

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL (calcineurin B-like protein)与其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)组成的CBL-CIPK系统,在真核生物钙信号转导及各种胁迫应答途径中发挥重要作用.采用SMART与LD-PCR技术构建了山葡萄'双丰'(Vitis amurensis Rupr.'Shuangfeng' )叶片组织低温胁迫下的均一化酵母双杂交三框cDNA文库,库容量分别为1.7 × 106、1.3 × 106与1.9 x 106 cfu · mL-1,外源基因插入片段长度约为500～2 000 bp,重组率为100％,符合后续双杂交筛选要求.以本课题组前期鉴定受低温诱导表达、具有核质亚细胞定位的山葡萄VaCIPK18全长(VaCIPK18)、激酶结构域缺失(VaCIPK18△S-TKc)以及NAF结构域缺失(VaCIPK18△NAF)为诱饵,进行酵母双杂交筛选,获得了17个候选互作靶蛋白;从中选取并克隆了7个参与非生物胁迫的候选互作蛋白进行酵母回转验证,仅发现1个ABA信号通路上游信号调节因子VaPYL9与VaCIPK18有互作关系.通过酵母双杂交和双分子荧光互补验证,确定了VaPYL9可与VaCIPK18和VaCIPK18△NAF在酵母中物理互作,而在植物拟南芥原生质体中VaPYL9与VaCIPK18△S-TKc和VaCIPK18△NAF互作,但与全长VaCIPK18不互作.