PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究

• 作者: 乔亮 俞俊岭 孙永 张栋 杨奕 王俊 陈晴晴
• 来源期刊: 中国全科医学
• 关键词: 新型冠状病毒肺炎 新型冠状病毒 PCR-飞行质谱系统 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 核酸检测
• 年，卷（期）: 2020,（35）
• 所属期刊栏目: COVID-19专栏
• 页码范围: 4430-4435,4442
• 页数: 7页
• 分类号: R563.14
• 语种: 中文
• DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2020.00.588

摘要

背景 新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球暴发,实验室检测结果是疾病诊断的重要依据,检测方法的灵敏度和特异度是影响实验结果的关键因素,现实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)核酸检测方法是COVID-19确诊的通用方法,但其检测灵敏度有方法局限性,依赖标本病毒含量.通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化,从而提高对低新型冠状病毒(SARS-CoV-2)含量病例检测的灵敏度,可为现有方法做有效补充.目的 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理,在Clin-ToFⅡ飞行时间质谱系统上,建立PCR-核酸飞行时间质谱(PCR-TOF MS)系统检测SARS-CoV-2的方法,并评估其实际应用价值.方法 2020年2—3月于上海市临床检验中心室间质评阳性样本40份、阴性样本7份,国家卫生健康委员会室间质评阳性样本41份、阴性样本33份,本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份,健康人样本28份,空白对照超纯水5份,共186份样本作为建立PCR-TOF MS系统数据.于2020年1—2月收集安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份(咽拭子样本55份、痰液样本25份)及健康人群样本20份(均为咽拭子样本)作为评估PCR-TOF MS系统效果的数据.建立PCR-TOF MS系统试验体系步骤,包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶(SAP)消化、单碱基延伸和质谱检测;并基于阳性质粒优化模版量,根据186份样本检测质谱峰的信噪比(SNP)确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准.对80份疑似SARS-CoV-2样本和20份健康人群样本进行检测分析,并与实时荧光定量PCR法进行对比.结果 通过对PCR-TOF MS模板条件的优化,模版量6μl时,扩增产物可获得典型的质谱峰图.建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2核酸的开放读码框1ab(ORF1ab)基因和核壳蛋白(N)基因进行有效扩增检测.本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00％,高于实时荧光定量PCR法的75.00％,同时,结果显示,实时荧光定量PCR法检出中含有25.00％的可疑结果,而PCR-TOF MS则无可疑结果.对于痰液和咽拭子两种样本的检出率,PCR-TOF MS法分别为100.00％和85.45％,高于荧光定量PCR法的64.00％和43.64％.阴性样本两种方法均未检出.结论 通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合,使得检测SARS-CoV-2目标片段指数级扩大,从而提高样本的检测灵敏度.MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析,具有较高的准确性和特异性,同时证实了痰液样本优于咽拭子样本.该方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同,在一定程度上有利于弥补假阴性的问题,从而降低临床漏诊率,提高检测效率,为疫情的研判缩短时间.