人PINK1-shRNA载体的构建及对神经母细胞瘤细胞线粒体的影响

• 作者: 于雪 冯婧 刘燕 张淑静 王淑艳 胡京红 许明阳 郭振宇 马浩洁
• 来源期刊: 现代生物医学进展
• 学科: 医学
• 关键词: PINK1基因shRNA质粒 SH-SY5Y细胞 线粒体功能障碍 帕金森病
• 年，卷（期）: 2020,（22）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 4207-4212
• 页数: 6页
• 分类号: Q95-3|Q78|R742.5
• 语种: 中文
• DOI: 10.13241/j.cnki.pmb.2020.22.002

摘要

目的:构建筛选人源靶向特异PINK1-shRNA敲减质粒,转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率,观察对细胞线粒体形态的影响.方法:构建两对人源PINK1-shRNA序列(编号分别为PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42),将这2对干扰序列连接在载体上形成重组载体,经测序验证后,将空载体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y细胞,获得基因敲减的细胞模型,用CCK-8法检测细胞的存活率,用荧光定量PCR方法确定PINK1基因的敲减效率,用蛋白质免疫印迹法验证细胞内PINK1的表达水平是否发生改变,用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变.结果:我们提取的质粒,经测序结果显示,质粒载体构建成功;转染细胞后,CCK-8法检测细胞存活率发生了降低,与正常组比较,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒组,细胞的存活率分别降低了13.7％(P＜0.05)和14.1％(P＜0.05);荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,PINK1-shRNA-39组和PINK1-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PINK1基因的表达分别降低了24.1％(P＜0.01)和36.7％(P＜0.01);蛋白质印迹法结果显示,与正常组相比,两对质粒分别转染细胞后,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01),PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平有效降低更明显;与正常组比较,激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部分发生断裂,碎片较多,基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:成功构建了人源的PINK1基因敲减的质粒,并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y细胞中,细胞内PINK1基因的mRNA和蛋白的表达水平降低,且细胞线粒体的形态发生了改变.