Kdm2b基因敲入双loxp序列的NIH3T3细胞株的构建

• 作者: 卢文显 杜生荣 林典梁 林运鸿 郑备红 陈素珠
• 来源期刊: 山东医药
• 学科: 医学
• 关键词: 组蛋白去甲基化酶 Kdm2b基因 条件性基因敲除 基因编辑 CRISPR/Cas9系统 Cre-loxp系统
• 年，卷（期）: 2020,（32）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 22-26
• 页数: 5页
• 分类号: R394
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-266X.2020.32.006

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9技术与同源重组技术在组蛋白去甲基化酶Kdm2b基因的特定位置敲入双loxp序列,为后期制备条件性敲除鼠及基因功能研究提供基础.方法 利用CRISPR/Cas9靶向性原理,根据Kdm2b基因第7个外显子的5臂端和第9个外显子的3臂端设计两个sgRNA,构建sgRNA-PX459重组质粒.从Kdm2b基因上克隆出同源臂,将同源臂插入带有loxp序列的Vector 5中,利用引物从Vector 5质粒克隆得到loxp-同源臂序列的双链Donor DNA.通过脂质体转染将sgRNA-PX459重组质粒和双链Donor DNA导入小鼠NIH3T3细胞,利用嘌呤霉素筛选细胞,挑选阳性单克隆.提取NIH3T3细胞基因组进行PCR,对PCR产物酶切鉴定,同时对Kdm2b基因进行测序.结果 电泳和测序结果显示sgRNA-PX459重组质粒构建成功,双链Donor DNA测序结果与设计相符合,成功在NIH3T3细胞Kdm2b基因上第7个外显子的5臂端和第9个外显子的3臂端各敲入一个loxp序列.结论 获得Kdm2b基因敲入双loxp序列的NIH3T3细胞株.