产碱杆菌Alcaligenes sp.KS-85来源肌酸酶活性中心的关键氨基酸功能研究

• 作者: 郝俊尧 马富强 杨广宇
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: 肌酸酶 活性中心 催化效率 分子对接 功能氨基酸
• 年，卷（期）: 2021,（3）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 75-83
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0830

摘要

肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3)水解肌酸生成尿素和肌氨酸,是肌酐多酶级联检测中的关键酶.为进一步解析产碱杆菌来源肌酸酶的催化机理,利用蛋白质同源建模、分子对接、丙氨酸扫描技术分析了酶与底物的相互作用,并聚焦于酶活性中心4个功能未知的保守位点Phe64、Asp102、Phe252、Phe321,通过将氨基酸残基定点突变为6种具有代表性的氨基酸,结合生化实验对其功能进行解析.经研究,所有突变体的kca值大幅度降低;除6个突变体:F252A、F252S、F252Y、F252W、F321A、F321Y的KM值降低,其余突变体的KM均提高.结构分析表明Phe252通过与Tyr259形成的π-π堆积稳定酶-底物复合体;Asp102通过与Arg66,Gly322的氢键相互作用稳定酶反应的过渡态;Phe321,Phe64位于底物两侧,通过疏水侧链的排斥作用及空间位阻影响底物的定位.本研究通过对活性中心氨基酸残基的功能解析,为肌酸酶的催化机制解析和分子改造奠定了基础.