电穿孔法可用于家蚕基因功能分析

• 作者: 周文林 藤原晴彦 上村望 叶爱红 武雪会 陈学东 张婷婷 曹锦如
• 来源期刊: 昆虫学报
• 关键词: 家蚕 电穿孔 转基因 Wnt1 RNAi 基因功能
• 年，卷（期）: 2021,（7）
• 所属期刊栏目: 生理与生化|Physiology and Biochemistry
• 页码范围: 809-816
• 页数: 8页
• 分类号: Q966
• 语种: 中文

摘要

[目的]明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效.[方法]针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1(Wingless),人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi),以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control,NC),解剖5龄幼虫斑纹区的表皮,用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量,验证电穿孔介导的RNAi效果.带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR,通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫;正常饲养72 h后,用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达,验证当世代家蚕的嵌合体转基因.[结果]家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后,5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制,实时定量RT-PCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低.嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60％,并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达.[结论]电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA,是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法.