利用慢病毒感染构建稳定敲低Atg5基因的RAW264.7细胞系

• 作者: 冼国炎 叶勇裕 张紫机 潘柏祺 盛璞义 郑霖力 陈蔚深
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 慢病毒 基因 基因敲低 自噬 蛋白 细胞学 细胞群 巨噬细胞
• 年，卷（期）: 2021,（1）
• 所属期刊栏目: 细胞相关基础实验
• 页码范围: 84-89
• 页数: 6页
• 分类号: R459.9|R392.1|R318
• 字数: 7543字
• 语种: 中文

摘要

背景:巨噬细胞自噬在调节免疫系统和炎症反应中起到关键作用,而敲低Atg5基因可以特异性抑制细胞自噬的发生.由于传统siRNA转染方法存在瞬时性和不彻底性等问题,构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系对于研究自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制有重要的价值和意义.目的:利用慢病毒感染的方法构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系,为研究巨噬细胞自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制提供底盘细胞.方法:构建带有绿色荧光信号、Puro抗性基因和敲低Atg5基因的重组表达载体(HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro)转染293T细胞得到慢病毒质粒系统,采用获取的慢病毒感染RAW 264.7细胞,在倒置荧光显微镜下观察病毒感染细胞的绿色荧光信号,嘌呤霉素抗性筛选,流式细胞分选得到高纯度的感染细胞,采用RT-qPCR和Western blot验证Atg5基因的敲低效率.结果与结论:DNA测序结果表明Atg5基因干扰序列均正确插入表达载体,HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro表达载体构建成功.慢病毒质粒感染RAW 264.7细胞系后,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光,流式细胞分选仪可见绿色荧光蛋白阳性细胞群.RT-qPCR和Western blot检测结果表明筛选出的RAW 264.7细胞系中Atg5基因表达水平显著下降(P<0.05),表明稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系构建成功.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	盛璞义	中山大学附属第一医院关节外科	35	202	9.0	13.0
2	张紫机	中山大学附属第一医院关节外科	25	57	5.0	6.0
3	叶勇裕	中山大学附属第一医院关节外科	2	0	0.0	0.0
4	陈蔚深	中山大学附属第一医院关节外科	2	0	0.0	0.0
5	冼国炎	中山大学附属第一医院关节外科	2	0	0.0	0.0
6	潘柏祺	中山大学附属第一医院关节外科	2	0	0.0	0.0
7	郑霖力	中山大学附属第一医院关节外科	2	0	0.0	0.0