高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞

• 作者: 李富荣 杨晓菲 王晗月 胡巢凤
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 体细胞 胰岛样细胞 肝 细胞基因转染 糖尿病 CRISPR/dCas9 因子 蛋白 通路
• 年，卷（期）: 2021,（7）
• 所属期刊栏目: 细胞相关基础实验
• 页码范围: 1056-1063
• 页数: 8页
• 分类号: R459.9|R363|R364
• 字数: 7987字
• 语种: 中文

摘要

背景:胰岛细胞移植是治疗糖尿病最有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用.在体外进行肝细胞向胰岛β细胞的直接重编程是解决该问题的一个新思路,但肝细胞向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程.目的:利用构建的CRISPR/dCas9-Pumilio系统(Casilio系统),通过改造向导RNA序列,与转录激活子PUFa-P65-HSF1结合,实现高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞.方法:采用脂质体转染法将Casilio体系(PNM)转染至HEK293T细胞系,靶向激活肝细胞内源PNM(Pdx1,Ngn3及MafA)基因,利用实时荧光定量PCR及免疫荧光检测内源PNM的表达.利用携带Ins-promoter-EGFP的慢病毒构建增强型绿色荧光蛋白稳定表达的Ins-EGFP HepG2细胞系,PiggyBac(PB)转座系统在此细胞系中构建核酸内切酶失活的Cas9(dCas9)和PUFa-P65-HSF1稳定表达的稳转细胞系.用脂质体向稳转细胞系分别转染针对PNM的向导RNA,然后实时荧光定量PCR和免疫荧光检测内源基因PNM的表达水平,并观察重编程效率.结果与结论:①实验在293T细胞系中验证了Casilio体系对内源基因的激活作用;②RT-PCR、Western Blot及免疫荧光检测验证了稳转细胞系中EGFP、dCas9和PUFa-P65-HSF1的表达;③实时荧光定量PCR证实靶向激活PNM的新型Casilio体系可实现内源PNM基因表达明显上调,直接重编程效率为10％-15％;④上述数据说明基于CRISPR/dCas9的新型Casilio体系,可成功激活肝脏内源PNM基因,可初步实现肝细胞系直接重编程为胰岛样细胞.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	胡巢凤	暨南大学基础医学院病理生理学系	46	252	10.0	13.0