敲除ebony基因导致二化螟体表黑色素沉积

• 作者: 孙浩 黄镜梅 刘艳 葛文超 王帅 杨凤霞 高聪芬 吴顺凡
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 二化螟 基因编辑 CRISPR/Cas9 ebony 标记基因 表型 脱靶效应
• 年，卷（期）: 2021,（12）
• 所属期刊栏目: 生理生化|Physiology and Biochemistry
• 页码范围: 1367-1376
• 页数: 10页
• 分类号: Q966
• 语种: 中文
• DOI: 10.16380/j.kcxb.2021.12.002

摘要

[目的]二化螟Chilo suppressalis是中国和其他亚洲地区为害水稻的重要害虫.由于缺乏遗传学操作工具,对二化螟的功能基因组学研究受到严重限制.本研究的目的是借助一个标记基因ebony,在二化螟体内建立CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系.[方法]以家蚕Bombyx mori ebony蛋白作为参考序列,通过TBLASTN程序在二化螟基因组数据库获得二化螟ebony基因的cDNA序列;通过PCR技术克隆二化螟ebony全长序列并进行生物信息学分析;运用qRT-PCR技术分析二化螟ebony基因在不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和雌雄成虫)和4龄幼虫不同组织(头、表皮、脂肪体、肠道和马氏管)中的表达模式;借助基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术,把sgRNA/Cas9蛋白复合物显微注射到二化螟新鲜的卵内(产卵后2h内),靶向敲除二化螟ebony基因.[结果]克隆得到二化螟Csebony基因(GenBank登录号:MZ846208)的全长cDNA序列,开放阅读框长为2586 bp,共编码861个氨基酸.Csebony蛋白质的分子质量为9.5 kD,理论等电点为5.10,且在N端没有信号肽.结构域分析显示,Csebony有3个保守的结构域.系统发育树显示,Csebony与玉米螟Ostrinia furnacalis的ebony亲缘关系最近.qPT-PCR结果显示Csebony基因在蛹期和头部高表达.敲除Csebony导致二化螟幼虫、蛹以及成虫黑色素沉积.[结论]本研究结果表明,Csebony参与了二化螟表皮颜色模式的调控;CRISPR/Cas9基因组编辑技术可在二化螟中有效应用.借助标记基因在非模式生物中快速建立CRISRP/Cas9基因编辑体系,可为二化螟的功能基因组学研究提供有价值的遗传学工具.