两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

• 作者: 甘玉迪 孙康 李会娟 堵忠颖 赵真 庞鑫 黎星辉 陈暄
• 学科: 农学
• 关键词: 茶树 多酚氧化酶 原核表达 酶活性
• 年，卷（期）: 2022,（4）
• 页码范围: 396-405
• 页数: 9页
• 分类号: TS272.2,Q52
• 语种: 中文

摘要

为了选择合适载体，获得稳定表达且具有高活性的可溶性茶树多酚氧化酶，本研究以茶树叶片为材料，克隆茶树多酚氧化酶基因（CsPPO），切除含43个氨基酸和70个氨基酸的肽段后分别与pET32a载体、pMAL-c5X载体进行重组构建原核表达载体，分别命名为pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70，利用E.coil Transetta（DE3）菌株进行表达，经SDS-PAGE电泳检验，pMAL-c5X载体表达的目的蛋白易于提取，大量出现在上清液中；而pET32a载体表达后蛋白则基本存在于沉淀中。利用邻苯二酚、ECG、EC3种底物在410nm处检测CsPPO蛋白活性发现，pMALc5X-CsPPO对不同底物反应时酶活性随时间增加均呈现明显“S”型变化，表明茶树PPO氧化儿茶素类的反应并不是匀速过程。pMALc5X-CsPPO43比活力比pMALc5X-CsPPO70的高，其中pMALc5X-CsPPO43与EC反应时酶比活力最高，最大比活力为1.45×106 U·mg-1。因此，可利用pMALc5X-CsPPO43合成工业用PPO，为进一步研究其与儿茶素的反应机理，利用体外酶法高效获得茶黄素奠定基础。