斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

• 作者: 吴坤坤 徐行 季策 任建峰 李伟明 张庆华
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: 斑马鱼 notch3 N3ICD 免疫荧光 真核表达载体 NF-κB
• 年，卷（期）: 2022,（1）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 179-186
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0289

摘要

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达.其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技术构建pCMV-N3ICD表达载体.再通过双酶切和测序筛选阳性重组载体,借由脂质体法转染至HEK293T细胞中,最后经细胞免疫荧光技术和蛋白质印迹法验证N3ICD的表达.结果显示,重组质粒经酶切电泳片段及测序比对均与预期结果一致.在蛋白质印迹实验中N3ICD蛋白可正常表达,且大小与预测结果一致.细胞免疫荧光显示重组质粒可以在HEK293T细胞的细胞核中表达.同时,构建的N3ICD真核表达载体能够明显增强NF-κB(nuclear factor-кB)家族中rela和nfκb1启动子的活性.成功构建了pCMV-N3ICD真核表达载体.