Vγ4T细胞在应用雷帕霉素的小鼠全层皮肤缺损创面愈合障碍中的作用及其机制

• 作者: 刘中阳 程旭 张景霞 张建文 郭丽丽 李广帅 史珂
• 来源期刊: 中华烧伤与创面修复杂志
• 关键词: 西罗莫司 伤口愈合 趋化因子CCL20 Vγ4T细胞 白细胞介素22
• 年，卷（期）: 2022,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 462-470
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20201209-00523

摘要

目的:探讨Vγ4T细胞在应用雷帕霉素的小鼠全层皮肤缺损创面愈合障碍中的作用及其机制。方法:采用实验研究方法，选取86只8~12周龄雄性C57BL/6J小鼠（以下简称野生型小鼠）进行后续实验。取5只野生型小鼠，从其腋窝淋巴结分离Vγ4T细胞用于后续实验。取42只野生型小鼠，腹腔注射雷帕霉素建立应用雷帕霉素的小鼠模型，用于后续实验。取18只野生型小鼠，按随机数字表法（分组方法下同）分为不进行任何处理的正常对照组和单纯创伤组、创伤+CC趋化因子配体20（CCL20）抑制剂组（每组6只），将后2组小鼠背部制成全层皮肤缺损创面（创面模型下同），创伤+CCL20抑制剂组小鼠伤后连续3 d于创缘皮下注射CCL20抑制剂，另取6只应用雷帕霉素的小鼠建立创面模型作为雷帕霉素+创伤组，伤后3 d，采用酶消化法提取各创伤小鼠创周皮肤组织的表皮细胞，采用流式细胞仪检测表皮细胞中Vγ4T细胞的百分比。于适宜时间点取正常对照组小鼠背部正常皮肤组织的表皮细胞同前进行检测。取5只野生型小鼠建立创面模型，伤后3 d，提取创周皮肤组织的表皮细胞，采用流式细胞分选仪将细胞群分为Vγ4T细胞、Vγ3T细胞及γδ阴性细胞，分别设为Vγ4T细胞组、Vγ3T细胞组及γδ阴性细胞组（均与B16小鼠黑色素瘤细胞混合），以单纯B16小鼠黑色素瘤细胞为黑色素瘤细胞对照组，采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法检测各组细胞白细胞介素22（IL-22）mRNA表达情况（样本数为6）。取30只应用雷帕霉素的小鼠建立创面模型，伤后即刻分为进行相应注射处理的单纯Vγ4T细胞组与Vγ4T细胞+IL-22抑制剂组以及注射PBS的雷帕霉素对照组（每组10只）；另取10只野生型小鼠建立创面模型并注射PBS作为野生型对照组。各组小鼠均连续注射6 d，伤后1、2、3、4、5、6 d于当日注射后计算4组小鼠创面面积百分比。分别取6只野生型小鼠和6只应用雷帕霉素的小鼠建立创面模型，作为野生型组和雷帕霉素组，伤后3 d，分别采用实时荧光定量RT-PCR法及蛋白质印迹法检测2组小鼠创周表皮组织中IL-22、CCL20的mRNA及蛋白的表达情况。取Vγ4T细胞，分为不进行任何处理的正常对照组和用雷帕霉素处理的雷帕霉素组，培养24 h，分别采用实时荧光定量RT-PCR法及蛋白质印迹法检测2组细胞中IL-22的mRNA及蛋白表达情况（样本数为6）。数据分析采用独立样本 t检验、重复测量方差分析、单因素方差分析、Bonferroni法、Kruskal-Wallis H检验与Wilcoxon秩和检验。 结果:单纯创伤组小鼠伤后3 d创周皮肤组织的表皮细胞中Vγ4T细胞百分比为0.66%（0.52%，0.81%），明显高于正常对照组小鼠正常皮肤组织的表皮细胞中的0.09%（0.04%，0.14%）， Z=4.31， P<0.01；雷帕霉素+创伤组及创伤+CCL20抑制剂组小鼠伤后3 d创周皮肤组织的表皮细胞中Vγ4T细胞百分比分别为0.25%（0.16%，0.37%）、0.24%（0.17%，0.35%），均较单纯创伤组明显降低（ Z值分别为2.27、2.25， P<0.05）。Vγ4T细胞组细胞中IL-22 mRNA表达水平明显高于Vγ3T细胞组、γδ阴性细胞组、黑色素瘤细胞对照组（ Z值分别为2.96、2.45、3.41， P<0.05或 P<0.01）。与野生型对照组比较，雷帕霉素对照组小鼠伤后1~6 d创面面积百分比均明显增大（ P<0.01），Vγ4T细胞+IL-22抑制剂组小鼠伤后1 d及伤后3~6 d创面面积百分比均明显增大（ P<0.05或 P<0.01）。与雷帕霉素对照组比较，单纯Vγ4T细胞组小鼠伤后1~6 d创面面积百分比均明显减小（ P<0.05或 P<0.01）。与单纯Vγ4T细胞组比较，Vγ4T细胞+IL-22抑制剂组小鼠伤后3~6 d创面面积百分比均明显增大（ P<0.05或 P<0.01）。伤后3 d，与野生型组比较，雷帕霉素组小鼠创周表皮组织中IL-22蛋白及mRNA的表达水平（ t值分别为-7.82、-5.04， P<0.01）、CCL20蛋白及mRNA的表达水平（ t值分别为-7.12、-5.73， P<0.01）均显著下降。培养24 h，雷帕霉素组Vγ4T细胞中IL-22蛋白及mRNA的表达水平均显著低于正常对照组（ t值分别为-7.75、-6.04， P<0.01）。 结论:在全层皮肤缺损小鼠中，雷帕霉素可能通过抑制CCL20表达使CCL20趋化系统受损导致Vγ4T细胞向表皮的募集减少，并同时抑制Vγ4T细胞分泌IL-22从而减缓创面愈合速度。