新型天冬氨酸激酶突变株构建及酶学性质表征

• 作者: 樊占青 刘晓婷 魏贞 王哲人 王亚南 高欣 闵伟红
• 来源期刊: 食品科学
• 学科: 生物学
• 关键词: 天冬氨酸激酶 定点突变 酶活力 分子动力学模拟 酶学性质
• 年，卷（期）: 2022,（2）
• 所属期刊栏目: 生物工程|Bioengineering
• 页码范围: 62-69
• 页数: 8页
• 分类号: Q517
• 语种: 中文
• DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20201126-276

摘要

通过定点随机突变技术,提高天冬氨酸代谢途径中首个关键限速酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)的催化活力,减弱或解除代谢产物对其协同反馈抑制,并通过Discovery Studio等软件对其空间结构进行分析,借助分子动力学模拟对其机制进行分析.首先选择ATP附近关键残基位点,在前期T379N/A380C/G171I突变株的基础上进行突变株构建,然后通过高通量筛选,获得酶活力显著提高的突变株T379N/A380C/G 171I/S227D.动力学分析显示,Vmax值增至242.05 U/ (mg·min),较T379N/A380C/G171I突变株(187.88 U/ (mg·min))提高到1.28倍,较野生型(wild type,WT) AK (3.01 U/ (mg·min))提高到80.41倍;Km值减小为1.35 mmol/L,底物亲和力增大.最后通过Discovery Studio软件和分子动力学模拟分析发现,突变后体系状态稳定,与ATP的氢键占有率增加,与底物的结合稳定性增强,有利于催化反应进行.酶学性质研究表明:该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的最适反应温度增至30℃,较WT和T379N/A380C/G 171I分别提高5℃和2℃;最适pH值为8.5,较T379N/A380C/G171I (pH 9.0)减小0.5;半衰期为3.9h,较T379N/A380C/G171I延长0.8h;且在不同浓度抑制剂Lys、Thr和Met以及Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met和Lys+Thr+Met不同组合存在情况下,该突变株表现出明显的激活作用,抑制效果减弱显著,激活作用最高143.35％.