湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6分子特征及其多克隆抗体制备

• 作者: 胡聂文 唐仪阳 冯孟哲 周泽军 省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室/湖南师范大学生命科学学院
• 来源期刊: 南方农业学报
• 学科: 农学
• 关键词: 湘云鲫2号 异源三倍体鱼 肠道干细胞 LGR6 原核表达 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2024,（9）
• 所属期刊栏目: 水产病害防治与水产品质量安全
• 页码范围: 200-209
• 页数: 10页
• 语种: 中文

摘要

【目的】克隆湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6(3nLGR6)并制备多克隆抗体，为从肠道干细胞角度揭示湘云鲫2号的抗病机制提供技术支持。【方法】通过PCR扩增3nLGR6基因开放阅读框(ORF)序列，采用InterProScan、TMHMM Server 2.0、ExPASy Proteomics Server、SignalP 5.0、PSORTⅡPrediction、SoftBerry-Psite、SWISS-MODEL及MEGA 11.0等在线软件进行生物信息学分析；利用原核表达系统表达融合蛋白，以纯化的融合蛋白免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体，基于免疫组织化学分析3nLGR6在湘云鲫2号肠组织中的分布情况。【结果】3nLGR6基因ORF序列全长2874 bp，共编码957个氨基酸残基；3nLGR6蛋白理论分子量约105.4 kD，理论等电点(p I)为5.44，在其N端有1个亮氨酸重复序列结构域，C端存在1个7次跨膜结构的GPCR结构域，且在18Gly与19Ser间存在信号肽切割位点(Sec信号肽)。3nLGR6与其他硬骨鱼类的LGR6氨基酸序列高度同源，其中与二倍体斑马鱼的相似性为92.28%。与鱼类LGR6作用密切的基因有LGR4、RNF43、RSPO2、CTNNB1、APC和CTNNA1，主要涉及Wnt信号通路和Adherens junction信号通路。以纯化得到的融合蛋白3nLGR6免疫BALB/c雌性小鼠，能成功制备出小鼠抗3nLGR6多克隆抗体，且免疫组化试验结果显示该抗体可特异性识别湘云鲫2号肠道组织中的3nLGR6。【结论】3nLGR6与其他物种的LGR6氨基酸序列高度同源，其结构和功能相对较保守。制备获得的小鼠抗3nLGR6多克隆抗体能特异性识别湘云鲫2号肠道内源性3nLGR6，为后续深入研究LGR6在硬骨鱼组织中的表达情况及揭示LGR6在肠道黏膜稳态中的作用机制提供了技术支撑。