用RT-PCR方法从人胎肝细胞内克隆VEGF基因的研究

• 作者: 付小兵 孙丹 孙同柱 孙晓庆 盛志勇 陈伟
• 来源期刊: 感染、炎症、修复
• 年，卷（期）: 2001,（1）
• 所属期刊栏目: 论著摘要
• 页码范围: 15
• 页数: 1页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-8521.2001.01.027

摘要

血管内皮细胞生长因子具有维持血管正常功能,促进血管内皮细胞增殖,提高血管通透性,改变细胞外基质的等作用,与创伤组织的修复和血管生成密切相关.为此,本研究利用RT-PCR技术钓取VEGF基因的cDNA序列.具体方法是,用常规方法从胎肝组织中提取纯度高RNA后进行甲醛变性凝胶电泳;电泳结束后,在紫外灯下可看见凝胶上有28s和18s两条清晰的电泳带,其亮度之比约为2:1,这显示:获得的RNA较完整,没有降解.取适量胎肝细胞总RNA,遵循PolyATtract(mRNA Isolation System的操作要求分离纯化mRNA后,以Oligo(dT)为引物,遵循cDNASynthesis System操作步骤合成dscDNA.根据文献报道的VEGF基因序列,用Goldkey软件设计的PCR反应体系中的上下游引物,它们分别为:上游引物为:5'-CGGCTAGCGC-CTCCGAAACCA TGAACT-3',下游引物为:5'-GGTAC-CTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3',两条引物5'端下画线碱基序列分别为NheI和KpnI的酶切位点.以逆转录反应的产物dscDNA为模板,用保真性强的pfu TaqDNA聚合酶进行扩增,其中设计的上下游引物浓度各为1mM,反应参数为:94℃变性30秒,60℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,共25循环,最后于72℃继续保温5min,反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.研究发现:经PCR反应后,获得的DNA片段长度为470bp左右,与预先实验设计相吻合.用干净的刀片切下含DNA片段的凝胶条,以PCR产物纯化试剂盒回收.纯化的DNA片段催化dATP加尾后,插入pGEM-T-Easy克隆载体中,构建的重组体转化DH-5a细菌,筛选出的阳性克隆命名为pT-VEGF.提取的重组质粒DNA,用限制性内切酶NheI和KpnI进行双酶切鉴定,酶切得到470bp大小的DNA片段.这进一步表明:VEGF基因的cDNA序列已克隆成功.pT-VEGF阳性克隆在ABI377全自动测序仪上进行序列分析,结果显示:通过RT-PCR方法克隆出来的DNA序列,与Genebank网站上的人VEGF121的cDNA序列完全一致,由Kozak序列,转录起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.因此,本研究克隆出了表达VEGF的cDNA序列,为下一步构建VEGF基因的表达载体,揭示VEGF作用的分子机制和体外大规模合成VEGF细胞因子奠定基础.