P450cam突变体蛋白表达、纯化与结晶的改进及其四突变体(F87L/Y96F/L244A/V247A)晶体结构

• 作者: L.L.WONG 刘一苇 刘斌斌 娄智勇 孙蕾 庞海 徐峰
• 来源期刊: 生物化学与生物物理进展
• 学科: 化学
• 关键词: P450cam 四突变体 纯化 双波长检测 晶体结构
• 年，卷（期）: 2004,（7）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 611-615
• 页数: 5页
• 分类号: O641
• 字数: 4566字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-3282.2004.07.007

摘要

在P450cam突变体蛋白纯化过程中使用280 nm/392 nm双波长比值检测蛋白质纯度,采用β-巯基乙醇对蛋白质进行还原性保护,有效地缩短了纯化进程,纯化效率相应提高.以PEG 8000为沉淀剂经悬滴汽相扩散法筛选得到适合衍射的P450cam四突变体(F87L/Y96F/L244A/V247A)晶体,在Mar-Research面探测器系统上收集了0.22 nm分辨率的X射线衍射数据.采用同晶差值傅立叶法解析结构,最后的晶体学R因子和Rfree分别为0.197和0.247,键长偏差为0.001 77 nm,键角偏差为1.96°.结构测定显示P450cam四突变体(F87L/Y96F/L244A/V247A)和P450cam野生型的整体构象无重大变化,突变后活性口袋变大而疏水性增加,这与突变设计预期目标一致.