人线粒体肌酸激酶广泛型亚型在大肠埃希菌中的表达及抗体制备

• 作者: 于嘉屏 张建 王爱华 顾鹏飞
• 来源期刊: 临床检验杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 人线粒体肌酸激酶 基因克隆 原核表达 抗体制备
• 年，卷（期）: 2004,（5）
• 所属期刊栏目: 研究生园地
• 页码范围: 360-363
• 页数: 4页
• 分类号: R392.2
• 字数: 2649字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1001-764X.2004.05.014

摘要

目的获得人线粒体肌酸激酶广泛型亚型(uMtCK)的全长基因,在大肠埃希菌中表达,研制抗uMtCK多克隆抗体.方法采用逆转录PCR从培养的肿瘤细胞(Hela细胞)中成功扩增出1 062 bp的uMtCK的基因片段,插入到质粒pMD18-T中,经酶切和测序证实为uMtCK的基因编码序列,再插入到质粒pQE30,转化大肠埃希菌,诱导重组质粒pQE30-uMtCK表达酶融合蛋白.经亲和层析纯化,并进行SDS-PAGE、western blot鉴定及酶活性测定.纯化的uMtCK蛋白免疫家兔制备抗uMtCK多抗.结果RT-PCR扩增出的片段经酶切鉴定和测序证实为uMtCK的基因;在大肠埃希菌M15中实现了高效、可溶性的融合表达,表达量约17%.重组uMtCK具有CK样催化活性,表明原核表达的uMtCK具有类似于天然蛋白质的生物学活性.经免疫印迹分析,制备的抗uMtCK多抗适合作uMtCK的进一步分析之用.结论人uMtCK在大肠埃希菌中实现了高效表达,制备了针对uMtCK的抗体.