构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16 E6/E7基因的重组腺病毒

• 作者: 宋方洲 左国伟 张溢 成海恩 易发平 李成华 潘巍巍 赖国旗 马永平
• 来源期刊: 西安交通大学学报（医学版）
• 关键词: 人乳头瘤病毒 腺病毒 角蛋白启动子
• 年，卷（期）: 2006,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 421-425
• 页数: 5页
• 分类号: R373.39
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-8259.2006.05.002

摘要

目的 利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达.方法 应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA.氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达.结果 通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功.293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3 d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达.结论 利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA.这将为进一步研究HPV-16 E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础.