尖吻蝮毒腺cDNA文库的构建、金属蛋白酶基因克隆和序列分析

• 作者: 刘清华 张晓伟 李晨吉 胡松年 苏兴文 邱鹏新 银巍 颜光美
• 来源期刊: 中国药理学与毒理学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因文库 蝮蛇类 金属内肽酶类 序列分析
• 年，卷（期）: 2006,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 81-90
• 页数: 10页
• 分类号: R996.3
• 字数: 2057字
• 语种: 英文

摘要

目的构建非标准化尖吻蝮(五步蛇,Agkistrodon acutus)毒腺cDNA文库,随机挑取克隆测序,分析金属蛋白酶基因.方法以Trizol试剂提取新鲜尖吻蝮毒腺总RNA, 以superscriptⅡ反转录酶合成cDNA第一链并以DNA聚合酶Ⅰ连续合成第二链.双链DNA经过含EcoRⅠ酶切位点接头加接,末端磷酸化并以XhoⅠ内切酶酶切,按照< 0.25 kb, 0.25～0.5 kb, 0.5～1 kb, 1～2 kb 和 >2 kb 5个片段大小分别回收,随后与pBluescriptⅡ SK (+) 载体相连转化E.coli DH10B,构建成尖吻蝮毒腺cDNA文库. 随机挑取克隆5'端测序,共获得8696条高质量表达序列标签,经过序列拼接和聚类,这些序列在经过功能注释后最终被聚类成2855个基因聚类. 其中,发现一个由74个克隆组成的基因聚类(Agkihagin)为新的金属蛋白酶基因.经反转录和巢式PCR扩增该基因并对其进行结构分析.结果构建好的文库含有2.048×106个重组子,新的金属蛋白酶开框读码序列全长1827个核苷酸,编码608个氨基酸,属于 PⅢ型金属蛋白酶.其Zn2+结合模序HEMGHNLGIDH和去整合素模序DECD在进化上高度保守.结论该文库符合建库标准库容要求,为构建尖吻蝮毒腺基因表达谱和筛选新的目的基因提供了有效平台;克隆的金属蛋白酶基因与GenBank中其他蛇毒金属蛋白酶氨基酸序列同源性最高达87%,为研究蛇毒金属蛋白酶结构与功能的关系奠定了良好基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	胡松年	中国科学院北京基因组研究所	21	114	6.0	10.0
2	银巍	中山大学中山医学院生物化学教研室	20	97	5.0	9.0
3	苏兴文	中山大学中山医学院药理学教研室	22	128	6.0	10.0
4	邱鹏新	中山大学中山医学院药理学教研室	42	205	7.0	12.0
5	颜光美		38	166	7.0	10.0
6	张晓伟	中国科学院北京基因组研究所	9	23	3.0	4.0
7	刘清华	中山大学中山医学院药理学教研室	2	4	1.0	2.0
8	李晨吉	中国科学院北京基因组研究所	1	3	1.0	1.0