肿瘤相关抗原RCAS1重组质粒的构建与GST-RCAS1融合蛋白的表达和纯化及鉴定

• 作者: 沈芬平 洪学军 王青青
• 来源期刊: 浙江大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 抗原,肿瘤 RCAS1 重组质粒 GST-RCAS1融合蛋白 细胞凋亡
• 年，卷（期）: 2006,（4）
• 所属期刊栏目: 专题报道
• 页码范围: 377-383
• 页数: 7页
• 分类号: R730.231
• 字数: 5091字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2006.04.006

摘要

目的:构建RCAS1的重组质粒、表达GST-RCAS1融合蛋白并进行纯化和生物学活性鉴定.方法:从MCF-7细胞提取总RNA,通过RT-PCR得到RCAS1的扩增产物,纯化后用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切.选择pGEX-2T作为载体,用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后与上述酶切后DNA连接,转化感受态JM109大肠杆菌,挑单个菌落提取质粒进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒重新转化BL21大肠杆菌,用终浓度0.1 mmol/L的IPTG诱导表达GST-RCAS1蛋白,用GST亲和层析纯化并通过SDS-PAGE电泳和Western印迹试验证实.利用特异性抗RCAS1多抗(N-18和C-20)鉴定所表达的融合蛋白,通过流式细胞仪检测GST-RCAS1融合蛋白诱导活化T细胞凋亡的作用.结果:通过RT-PCR得到大小为642bp的产物,重组质粒通过双酶切和测序鉴定正确.通过IPTG诱导在BL21大肠杆菌中表达并纯化得到GST-RCAS1蛋白,通过SDS-PAGE电泳鉴定分子量为52 kMr,与预测一致,并由Western印迹试验证明为GST融合蛋白.该融合蛋白能被特异性抗RCAS1(N-18和C-20)多抗识别.GST-RCAS1对诱导活化的T细胞凋亡有一定的作用.结论:成功构建RCAS1的重组质粒,并表达GST-RCAS1融合蛋白,对其生物学活性作了初步研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王青青	浙江大学医学院免疫研究所	97	786	15.0	24.0
2	沈芬平	浙江大学医学院免疫研究所	12	77	5.0	8.0
3	洪学军	浙江大学医学院免疫研究所	3	6	2.0	2.0