地高辛(DIG)和碱性磷酸酶标记cDNA探针检测PRSV

• 作者: 伏卉 刘小梅 姜玲 张明涛 张红艳
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 番木瓜环斑病毒(PRSV) 地高辛(DIG)标记探针 碱性磷酸酶直接标记 杂交 RT-PCR
• 年，卷（期）: 2007,（3）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 496-502
• 页数: 7页
• 分类号: S188
• 字数: 5798字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2007.03.024

摘要

根据GenBank发表的PRSV(番木瓜环斑病毒)中国Sm株系的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,以美中红(Carica papaya L. cv.Meizhonghong)带病样品的RNA为模板进行RT-PCR扩增,将其目的cDNA片段克隆到pGEM-T easy质粒载体上.以重组质粒作模板,用PCR-DIG标记方法制备cDNA探针,另一种非放射性探针是经凝胶电泳分离、纯化cDNA片段,用碱性磷酸酶直接进行标记.利用地高辛(DIG)标记和碱性磷酸酶直接标记的cDNA探针核酸分子杂交及RT-PCR方法对PRSV进行了检测.结果表明,(1)测序结果表明美中红No.2序列与中国优势株系Sm的同源性为94.7%;(2)DIG标记的3种cDNA探针(861,455和215 bp)对样品的总RNA检测结果一致,且861 bp的探针杂交斑点最为清晰,上述核酸杂交结果与RT-PCR检测结果相符,核酸分子杂交检测的灵敏度和特异性能满足常规检测的需要;(3)碱性磷酸酶直接标记861 bp的cDNA探针可进行PRSV的斑点杂交检测,可获得有效的杂交结果;(4)DIG标记探针对叶脉进行了印迹杂交检测,结果与RT-PCR检测结果相符.