低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖及重金属钴的作用

• 作者: 刘国树 吴海涛 张翠萍 朱玲玲 王凡 范明 赵彤 陈晓萍
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 细胞低氧 成肌细胞,骨骼肌 细胞增殖
• 年，卷（期）: 2007,（3）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 419-422,426
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 5922字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.03.007

摘要

目的:观察低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞增殖的作用,并分析CoCl2对成肌细胞增殖的影响.方法:实验于2005-05/2006-07在解放军军事医学科学院基础医学研究所神经肌肉发育研究室完成.①低氧CO2温箱(Forma Scientific,美国);CoCl2(北京化工厂).②选取4～5周龄Wistar雄性大鼠5只,脱颈处死无菌切取后腿肌群,剪除脂肪和筋膜,制备单细胞悬液.以连续贴壁法筛选大鼠骨骼肌成肌细胞,接种于96孔板进行单克隆培养.采用成肌细胞特异性标志抗原desmin免疫化学染色,鉴定成肌细胞标志蛋白--结蛋白的表达,弃去desmin阴性的细胞克隆,继续培养desmin阳性的细胞克隆,隔天换液1次,7 d进行酶消化传代,获得大量扩增的细胞,并可冻存复苏,用于实验.③以1×107 L-1接种于20个35 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为5组:常氧对照组、轻度低氧组、中度低氧组、CoCl2组、轻度低氧+CoCl2组,4皿/组.常氧对照组置于体积分数为0.2的O2常规氧气环境中;轻、中度低氧组分别于低氧温箱中维持体积分数为0.1与0.03的O2低氧环境中;CoCl2组向培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2;轻度低氧+CoCl2组向细胞培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2后,放入体积分数为0.1的O2低氧温箱.低氧培养24,48,72 h时,各组取出培养皿进行细胞消化离心,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,血球计数板计数法进行细胞计数.④以1×108 L-1接种于8个60 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为2组:常氧对照组、轻度低氧组,4皿/组.两组干预措施同细胞计数过程.低氧培养48 h时,两组取出培养皿进行细胞消化离心,流式细胞仪检测细胞周期.结果:①骨骼肌成肌细胞的单克隆培养结果:成肌细胞可在体外存活6个月,增殖旺盛期约为3个月,可传代15次以上.单克隆培养2周后,可以由单个细胞长满96孔板中的1个孔,并不断扩增,最终可以得到细胞类型专一单克隆化的成肌细胞.②成肌细胞特异性标志抗原desmin鉴定结果:镜下不同视野desmin阳性率达100%,即培养的成肌细胞单克隆纯度达100%.③细胞计数结果:与常氧对照组比较,低氧培养24,48,72 h时轻、中度低氧组均可明显促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖,且轻度低氧组作用尤为明显(t=4.98,P＜0.001);CoCl2组无明显变化,但轻度低氧+CoCl2组细胞数量显著增加(t=4.62,P＜0.001).④细胞周期分布:与常氧对照组比较,低氧48 h时轻度低氧组处于S期的细胞明显增多[(26.67±0.89)%,(65.43±0.23)%,t=2.36,P＜0.01],且增殖指数亦显著上升(33.4%,67.1%,t=2.15,P＜0.01).结论:①轻中度低氧可以促进大鼠骨骼肌成肌细胞的增殖,为体外大量扩增细胞提供了新思路.②CoCl2对骨骼肌成肌细胞没有促增殖作用.