斑点免疫结合法测定卵黄抗体的活性

• 作者: 叶蕾 安梅 王桂华 邓淑芬 阮光萍
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 卵蛋白质类 免疫球蛋白类 染色与标记/方法
• 年，卷（期）: 2007,（12）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 2397-2400
• 页数: 4页
• 分类号: R4
• 字数: 1767字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.12.045

摘要

背景:哺乳动物产生的抗体和鸡产生的卵黄抗体在物理、生物活性方面存在差异.卵黄抗体能耐酸耐热,可口服用来防治动物和人类的肠内感染疾病,且对发展常规的诊断免疫实验有益.传统的ELISA法检测卵黄抗体比斑点免疫结合法费时.目的:应用斑点免疫结合法检测卵黄抗体的稳定性.设计:开放性实验.单位:解放军成都军区昆明总医院输血科.材料:实验于2006-01/06在解放军成都军区昆明总医院完成.选取30周龄的白色莱杭母鸡2只,以HLA-A*0201α链作为抗原,纯化抗原的总蛋白浓度0.04 g/L,相对分子质量为32 000(自行制备);硝酸纤维素膜(进口分装);脱脂奶粉(安怡产品,批号20051220);DAB(博士德公司);辛酸(上海星火化工厂生产);硫酸铵(汕头市光华化学厂生产).方法:①抗原HLA-A*0201α链以总蛋白浓度0.04 g/L纯化后,进行鸡卵黄抗体的纯化,采用SDS-PAGE电泳检测卵黄抗体的纯化结果.②1μL抗原被点样在硝酸纤维素膜的中心,于37℃孵箱中烤干,浸于1 mL的PBST中,37℃孵箱90 r/min封闭振荡15 min,重新更换1 mL的PBST,加入一抗卵黄抗体,终浓度为10 mg/L.在37℃孵箱振荡30 min后,硝酸纤维素膜用PBST洗3次.加入二抗标记HRP的鼠抗鸡卵黄抗体,孵育30 min后,硝酸纤维素膜用PBST洗3次,通过用DAB试剂孵育来显色.阳性反应产生一个深棕色的斑点,表明卵黄抗体具有较好的活性;斑点变浅表明失去部分活性;斑点消失表明失去全部活性.根据斑点的灰度值变化对照标准样品,可计算卵黄抗体剩余的百分活性.③卵黄抗体用磷酸盐缓冲液调整为1,0.1,0.01 g/L 3种蛋白浓度,室温下放置4个月,每个月分别从各种浓度的样品中取10μg,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体室温稳定性.④卵黄抗体分别置于7个EP管,100 μL/管,编号1～7.1～3号管用1 mol/L的HCL分别调整pH值为5,3,2;4～6号管用1 mol/L的NaOH分别调整pH值为9,11,12;7号管的pH值为7(中性),不加酸或碱.1～7号管均放在37℃孵箱中3 h,每隔1 h各管分别取10μg样品,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体不同pH值条件下的稳定性.⑤卵黄抗体分别置于6个EP管,10μL/管,编号1～6.按顺序编号各管分别于30,40,50,60,70,80℃水浴15 min,然后4℃冰箱冷却,每管取样10μg,以未经过加热处理的样品作为标准对照,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体热稳定性.主要观察指标:①卵黄抗体SDS-PAGE电泳检测.②卵黄抗体室温稳定性检测.③卵黄抗体不同pH值稳定性检测结果.④卵黄抗体热稳定性检测.结果:①纯化的卵黄抗体经SDS-PAGE电泳后有两条主带,重链相对分子质量约66 000,轻链相对分子质量约25 000.②1,0.1,0.01 g/L的卵黄抗体,室温下放置4个月后仍然保留部分活性.③pH 5～9时37℃孵育3 h后,卵黄抗体仍有部分活性;在pH低于5或高于9的条件下37℃孵育3 h后,卵黄抗体失去全部活性.④纯化的卵黄抗体分别置于6个EP管中,1～4号管的卵黄抗体仍有活性,第5管和第6管出现白色沉淀,可能是较高温度下蛋白变性引起的.结论:卵黄抗体稳定性较好,斑点免疫结合法能够快速简单的证明和描述卵黄抗体的功能活性,且只需要微量抗原和抗体,斑点特异,能同时处理大量样品.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	阮光萍	解放军成都军区昆明总医院输血科	4	3	1.0	1.0
2	安梅	解放军成都军区昆明总医院输血科	2	3	1.0	1.0
3	邓淑芬	解放军成都军区昆明总医院输血科	3	3	1.0	1.0
4	王桂华	解放军成都军区昆明总医院输血科	2	3	1.0	1.0
5	叶蕾	解放军成都军区昆明总医院输血科	2	2	1.0	1.0