小干扰RNA抑制HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制与表达

• 作者: 任广立 张卫云 彭智勇 方颖 欧巧群 王鲜艳 白雪帆 罗爱武 许蔓春 马恒颢
• 来源期刊: 实用儿科临床杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 乙型肝炎病毒 小干扰RNA 基因治疗 HepG2.2.15细胞
• 年，卷（期）: 2008,（22）
• 所属期刊栏目: 感染性疾病
• 页码范围: 1750-1753
• 页数: 4页
• 分类号: R725.1
• 字数: 4577字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1003-515X.2008.22.012

摘要

目的 了解基于载体的siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用,观察特异性siRNA载体对细胞的毒副作用及可能的非靶向效应,探讨新的抗病毒治疗手段.方法 根据GenBank收录HepG2.2.15细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV的C基因区的3条siRNA的双链复合体,经退火连接入p-Silencer-Cmv 4.1载体,连接产物转化JM109细胞,载体经聚丙烯酰胺凝胶电泳及测序鉴定后中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1转染HepG2.2.15细胞.免疫荧光及Western blot检测病毒蛋白HBsAg、HBeAg的表达;RT-PCR检测HBV RNA的表达变化;Real-time PCR定量检测HBV DNA拷贝变化.同时采用MTT法检测细胞的生长曲线与生长率.ELISA法检测IFN-α的表达变化.结果 Western Blot结果显示在转染第3大p-C2对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(81.15±0.69)%、(88.12±0.92)%,免疫荧光显示同样结果.RT-PCR检测结果显示C基因特异的表达性siRNA可以显著抑制HBV的mRNA表达,对C区HBV mRNA的抑制达96.9%.定量PCR检测显示特异性siRNA使HBV DNA拷贝数降低102个数量级.而MTT检测表明该特异性siRNA表达载体不影响细胞的生长曲线与生长率,治疗组与对照组比较无差异.ELISA法检测表明特异性siRNA并小影响细胞干扰素的表达,p-C1、p-C2、p-C3组与未转染组、p-NC组比较表达均无差异.结论 基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达.该抑制作用是特异性的,同时对细胞无明显毒副作用.该作用为基因水平的裂解作用,不会出现耐药现象.