具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定

• 作者: 刘亚伟 刘芸 吴向玲 姜勇 李涛 邓鹏
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因产物,tat 色谱法 亲和 抗生蛋白链菌素 钙调蛋白结合蛋白质类
• 年，卷（期）: 2010,（5）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 547-550
• 分类号: R34|R392.32
• 语种: 中文

摘要

目的 建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统.方法 应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒.将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能.结果 所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的 融合蛋白.细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性.结论 成功构建了pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体,并获得了具有良好穿透真核细胞膜功能的融合蛋白,为进一步研究细胞内蛋白相互作用、细胞穿透肽TAT的功能及其穿透细胞的机制奠定了基础.