靶向C基因的shRNA抗乙型肝炎病毒在BHK-21细胞中的复制与表达

• 作者: 严维耀 刘明秋 刘霜 孙璐璐 崔志磊 肖安 边中启 郑兆鑫 陈维灶 马世武
• 来源期刊: 中华医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肝炎病毒,乙型 RNA干扰 短发夹状RNA 微RNA 应急疫苗
• 年，卷（期）: 2010,（39）
• 页码范围: 2776-2781
• 分类号: R5
• 字数: 3974字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2010.39.011

摘要

目的 研究靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的shRNA(shRNA)诱导RNAi(RNAi)在BHK-21细胞中抑制HBV的复制与表达及抗病毒效果.方法 根据成都军区昆明总医院传染病中心克隆测序的中国56个民族CHB患者HBV基因组(基因型B属ayw1亚型)已在GenBank登录注册:CYN/2002和CYN/2000(GenBank登录号AY517488,AY517489,等),为了监测siRNA功能提供报告基因系统,将HBV C基因PCR产物克隆构建成报告基因表达载体pC-EGFP-N1和载体pCDNA3.1B(-),设计并构建两个靶向同源(CYN/2002和CYN/2000)毒株HBV C基因的长24核苷酸(nt)的shRNA表达质粒(S1和S2),随机设计的用于对照的非同源长24 nt的shRNA表达质粒S3,将其克隆到载体pU6上,构建成表达目的 shRNA重组表达载体,并与pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞.首先在BHK-21细胞中使用BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(EGFP)表达细胞数量,评估该shRNA表达质粒在转染后不同时间对C基因/EGFP融合报告基因表达的抑制作用,接着在BHK-21细胞中通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)进一步检验了shRNA抗病毒效果.结果 通过BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测,发现在shRNA表达质粒和pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞24 h后,与pC-EGFP-N1或pEGFP-N1单质粒转染相比,S1或S2的共转染组、S1+S2的共转染组使EGFP的表达水平降低了90%,而对照质粒S3或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达水平,差异有统计学意义(P＜0.01);应用RT-PCR检测C基因mRNA和EGFP基因mRNA的表达量,结果与BH-2型荧光显微镜和FACS-440型流式细胞仪检测结果相吻合,差异有统计学意义(P＜0.01).进一步证实了RNAi抗病毒效果,抗病毒效应持续时间超过48 h.结果 发现,创建的靶向C基因的shRNA能够有效特异地抗C-EGFP基因在BHK-21细胞中的复制与表达.结论 靶向C基因的RNAi技术能够有效特异地抗HBV在BHK-21细胞中的复制与表达.RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV安全有效的应急疫苗.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	郑兆鑫	复旦大学遗传所	29	280	10.0	16.0
2	严维耀	复旦大学遗传所	20	224	8.0	14.0
3	马世武	成都军区昆明总医院传染病中心	11	20	3.0	3.0
4	刘明秋	复旦大学遗传所	22	197	6.0	14.0
5	肖安	成都军区昆明总医院传染病中心	8	14	2.0	3.0
6	边中启	成都军区昆明总医院传染病中心	5	37	4.0	5.0
7	孙璐璐	成都军区昆明总医院传染病中心	1	6	1.0	1.0
8	陈维灶	复旦大学遗传所	2	6	1.0	2.0
9	崔志磊	成都军区昆明总医院传染病中心	2	15	2.0	2.0
10	刘霜	成都军区昆明总医院传染病中心	1	6	1.0	1.0