靶向沉默巨噬细胞中 Mcl-1基因 shRNA表达质粒的构建与鉴定

• 作者: 吴江东 吴芳 张万江 张雨晴 曹旭东 王婵 王新敏 王飞雨 章乐
• 来源期刊: 西安交通大学学报（医学版）
• 关键词: 髓细胞白血病-1 基因 Raw264.7 细胞 THP-1 细胞 结核分枝杆菌 短发夹 RNA
• 年，卷（期）: 2015,（4）
• 所属期刊栏目: 技术方法研究
• 页码范围: 558-564
• 页数: 7页
• 分类号: R392
• 语种: 中文
• DOI: 10.7652/jdyxb201504027

摘要

目的：研究髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)基因在小鼠巨噬细胞 Raw264.7和人巨噬细胞THP-1中的表达情况,筛选出表达含量高的细胞株作为实验用细胞,根据筛选的结果构建靶向小鼠 Mcl-1基因的短发夹 RNA(shRNA)真核表达质粒进行转染,最后筛选出沉默 Mcl-1基因效果最明显的 shRNA 表达质粒。方法利用半定量 RT-PCR 和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分别检测两种巨噬细胞中 Mcl-1mRNA 和蛋白表达情况。采用小分子干扰 RNA(siRNA)软件设计3个针对 Mcl-1基因不同位点的 shRNA 片段,由公司构建携带此 shRNA 片段的真核表达质粒(Mcl-1 shRNA1-3),然后通过脂质体将真核表达质粒载体转染到小鼠巨噬细胞株 Raw264.7中,24、48 h 后通过倒置荧光显微镜观察转染效果,并分别采用实时定量 PCR 和 Western blot 检测 Mcl-1 mRNA 和蛋白表达情况。结果小鼠巨噬细胞 Raw264.7中 Mcl-1的 mRNA 及蛋白质的表达显著高于人巨噬细胞,差异有统计学意义(P <0.05)；构建的 shRNA 表达载体在24、48 h 均能降低 Raw264.7细胞内 mcl-1 mRNA 和蛋白水平,尤其在48 h 沉默效果最为明显；转染48 h 后与正常组、脂质体组和阴性对照组相比,差异有统计学意义(P <0.05)；与 Mcl-1 shR-NA1和 Mcl-1 shRNA2相比,Mcl-1 shRNA3对 Mcl-1 mRNA 和蛋白的沉默作用最强。结论成功筛选出了实验所用细胞 Raw264.7及对小鼠巨噬细胞 Raw264.7内 Mcl-1具有明显沉默效果的靶向 Mcl-1 shRNA3真核表达质粒。