靶向Ang2的RNAi慢病毒载体的构建及其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的影响

• 作者: 刘照亮 单秀英 庄福连 张彦定 张明凤 王彪 王美水 蔡传书 郭国祥
• 来源期刊: 医学分子生物学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: RNA干扰 Ang2 慢病毒载体 恶性黑色素瘤
• 年，卷（期）: 2011,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 494-500
• 分类号: R34
• 字数: 5829字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3870/j.issn.1672-8009.2011.06.006

摘要

目的 构建携带促血管生成素2-小干扰RNA(Ang2-siRNA)慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的干扰作用.方法 将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒(pNL-EGFP)载体与pSilencer 1.0-U6启动子-促血管生成素2-小干扰RNA(pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA)重组质粒连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅰ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ)、加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅱ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ)慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白(pVSVG)包膜质粒和pHelper包装质粒共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Ang2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.0×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示:Ang2-siRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达(P＜0.05).结论 成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示Ang2-SiRNA慢病毒载体能抑制恶性黑色素瘤细胞中Ang2 mRNA的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的干预实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据.