rAAV-Slug-siRNA载体的构建及其抗胰腺癌的实验

• 作者: 于飞 余壮明 崔海宁 顾冠宏
• 来源期刊: 肿瘤防治研究
• 学科: 医学
• 关键词: Slug 小干扰 腺相关腺病毒 胰腺癌 凋亡
• 年，卷（期）: 2011,（3）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 265-269
• 分类号: R73-3|R735.9
• 语种: 中文
• DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2011.03.007

摘要

目的 构建并制备携带目的 基因的rAAV-EGFP Slug-siRNA(Slug-siRNA)病毒载体,探讨Slug 干扰抗胰腺癌作用.方法 首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316EGFP-Siuz-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收PCR产物;酶切pSNAV2.O-lacz-a载体质粒,并与上述产物进行连接;转化感受态大肠杆菌DH5a,得到重组质粒pSNAV2.OEGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定.建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRAN并对其纯化、鉴定和滴度测定.将体外培养的胰腺癌细胞株AsPC-1转染Slug-siRNA和pSNAV2.O-EGFP空载体.Western blot及RT-PCR方法鉴定转染前后AsPC-1细胞内PUMA及Slug蛋白及mRNA表达,MTT、比色法检测细胞存活率,TUNEL检查细胞凋亡.结果 携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确.将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV7-rc/AUL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒Slug-siR-NA,经检测目的 片段插入成功,滴度为9.23×1010 (puf).Slug-siRNA有效抑制AsPC-1细胞内Slug表达,抑制体外细胞增殖,促进细胞凋亡,同时,伴随着Slug表达的下降,细胞内PUMA表达明显增加.结论 成功制备出高滴度携带目的 基因的Slug-siRNA病毒载体.干扰Slug表达抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能通过解除Slug时PUMA基因的抑制有关.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	余壮明	海南医学院附属医院普外科	19	66	5.0	7.0
2	崔海宁	海南医学院附属医院普外科	40	162	8.0	10.0
3	于飞	海南医学院附属医院普外科	1	0	0.0	0.0
4	顾冠宏	海南医学院附属医院普外科	1	0	0.0	0.0