利用RNAi抑制牛骨髓间充质干细胞中朊蛋白基因（PRNP）的表达

• 作者: 刘玮 宋少康 杨莉 柏学进 牛召姗 王文明 董雅娟 赵仕全
• 来源期刊: 中国兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 疯牛病 PRNP 朊蛋白PrP^c shRNA BMSC
• 年，卷（期）: 2012,（11）
• 所属期刊栏目: 基础兽医学
• 页码范围: 1683-1688
• 分类号: S852.65
• 语种: 中文

摘要

利用RNAi技术，根据牛源PRNP基因eDNA设计3段siRNA序列和1个阴性对照序列，分别将其连接到RNA干扰载体pRNAT-U6．1／Neo上构建成shRNA载体，并将shRNA载体转染牛骨髓间充质干细胞（BMSC）；通过Real-timePCR和WesternBlotting筛选抑制效果最佳的载体；并用800mg／LG418对转染最佳载体的细胞进行药物筛选。结果显示：成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体；转染后48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光的表达；Real-timePCR和WesternBlotting结果显示，3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNPmRNA的表达，抑制了朊蛋白PrP^c 的生成，得到了1个最佳干扰载体sh3；通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。本研究获得了1个有效抑制朊蛋白基因表达的shRNA载体，并筛选出稳定转染的细胞单克隆，上述结果可为抗疯牛病体细胞核移植提供供体细胞。