甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

• 作者: 周丹 李杨瑞 杨丽涛 谢晓娜 陈明辉
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 甘蔗 宿根矮化病 PCR检测 16S～23S rDNA 优化体系
• 年，卷（期）: 2012,（5）
• 所属期刊栏目: 植物保护·农业气象
• 页码范围: 616-620
• 分类号: S435.661
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2012.05.616

摘要

[目的]在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx 16S～23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术.[方法]以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBuffer Ⅱ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系；稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度；用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定.[结果]优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx 16S～23S rDNA内部转录间隔区序列；能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA( 15.9 pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释10倍的Lxx基因组DNA( 159 pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定.对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7％,而常规的PCR检测RSD感染率为0.[结论]优化的PCR体系为:2xGC Buffer Ⅱ12.5 μL,Ex Taq DNA酶(5 U/μL)0.2 μL；dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL;Lxx1(10 μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μLcPCR反应程序为:95℃预变性10 min,94℃ 15s,57℃ 15 s,72℃ 30 s,40个循环；72℃延伸10 min.优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测.