RNA干涉介导大鼠成肌细胞系L6中MuRF-1与FOXO3a基因表达变化的研究

• 作者: 丁洁 冯勇 朱志祥 梁炳生 贾英伟 达志峰 韦建
• 来源期刊: 中华细胞与干细胞杂志（电子版）
• 关键词: 肌萎缩 MuRF-1 FOXO3a L6 去神经支配 RNA干扰 基因表达
• 年，卷（期）: 2013,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 87-93
• 页数: 7页
• 字数: 4237字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3877/j.issn.2095-1221.2013.02.007

摘要

目的 探讨RNAi 技术体外抑制MuRF-1 或FOXO3a 基因表达的效果,为RNAi 介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗奠定基础.方法 体外培养大鼠成肌细胞系L6,将MuRF-1 和(或)FOXO3a siRNA 重组质粒在Lipofectamine 2000 介导下转染,优化与检测系统的转染效率;将2 μg MuRF-1 或FOXO3a 基因siRNA 重组质粒转染L6,转染后48 h与72 h,采用实时定量PCR检测siRNA重组质粒对MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制效果,使用Western 印迹检测siRNA 重组质粒对MuRF-1 和FOXO3a 蛋白水平的抑制效果.用单因素方差分析方法和LSD 法进行组间比较.结果 ( 1)质粒转染后24 h,荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达,显示系统有较高的转染效率.(2)实时定量PCR分析结果显示:MuRF-1 与FOXO3a 各自的siRNA 重组质粒转染后48 h,二者干扰序列在mRNA 水平分别明显抑制了MuRF-1 和FOXO3a 的表达,抑制率达67 ﹪和54 ﹪,与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05),联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒转染后48 h,干扰序列在mRNA 水平明显抑制了MuRF-1 及FOXO3a 的表达,抑制率达61 ﹪及58 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05);转染后72 h,MuRF-1 与FOXO3a各自的siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 的mRNA 的抑制率分别达79 ﹪和81 ﹪,联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 的mRNA的抑制率达77 ﹪及72 ﹪,与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05),与48 h 相比,抑制效应更为明显.(3)Western 印迹灰度分析结果显示:转染后48 h,干扰序列MuRF-1明显抑制了MuRF-1 蛋白的表达,抑制率达61 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P <0.05),干扰序列FOXO3a 明显抑制了FOXO3a 蛋白的表达,抑制率达46 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 蛋白表达的抑制率达64 ﹪及42 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05);转染后72 h,干扰序列MuRF-1 对MuRF-1 蛋白表达的抑制率达70 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),干扰序列FOXO3a 对FOXO3a 蛋白表达的抑制率达72 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 蛋白表达的抑制率达73 ﹪及74 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),与48 h 相比,抑制效应更为明显,与对mRNA 水平的影响一致.(4)MuRF-1 的siRNA 重组质粒与联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列MuRF-1 对MuRF-1 的mRNA 和蛋白抑制效果相比差异无统计学意义(P >0.05),FOXO3a 的siRNA 重组质粒与联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列FOXO3a 对FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑制效果相比差异无统计学意义(P > 0.05).结论 ( 1)RNA 干扰技术在体外能够明显抑制泛素连接酶MuRF-1 和叉头蛋白转录因子FOXO3a 基因的表达.(2)体外研究中MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒联合转染与各基因siRNA 重组质粒单独转染其干扰序列对MuRF-1 或FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑制效果无差别.(3)活体实验中MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒联合转染与各基因siRNA 重组质粒单独转染其干扰序列对MuRF-1 或FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑制效果尚不明确,这为RNAi 介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供了一种新的思路.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	梁炳生	山西医科大学第二医院骨科	119	543	11.0	15.0
2	贾英伟	山西医科大学第二医院骨科	27	164	8.0	11.0
3	达志峰	山西医科大学第二医院骨科	6	25	3.0	5.0
4	朱志祥	山西医科大学第二医院骨科	5	22	2.0	4.0
5	丁洁	山西医科大学第二医院骨科	5	5	2.0	2.0
6	冯勇	上海市第六人民医院骨科	4	4	1.0	2.0
7	韦建	山西医科大学第二医院骨科	3	3	1.0	1.0